Imagem de lapso de tempo de fluorescência do ciclo de vida de Streptomyces venezuelae

Pegue uma placa microfluídica com um poço contendo esporos de Streptomyces venezuelae, uma bactéria formadora de hifas.

Outros poços designados contêm meio rico em nutrientes ou gasto.

Os esporos são derivados de uma cepa que expressa proteínas fluorescentes DivIVA e FtsZ, que se localizam nas pontas das hifas e nas paredes transversais, respectivamente.

Aplique óleo de imersão na lente objetiva de um microscópio invertido e na janela de imagem da placa.

Monte a placa no microscópio stage e comece a imagem de lapso de tempo.

Carregue os esporos na câmara de cultura da placa.

Em seguida, introduza o meio rico em nutrientes para iniciar a germinação dos esporos.

À medida que as hifas crescem, DivIVA se acumula nas pontas das hifas, enquanto FtsZ forma anéis dispersos nas paredes transversais.

Em seguida, mude para a mídia gasta. A falta de nutrientes neste meio suporta a esporulação.

Nas hifas brotadas, os focos de DivIVA desaparecem e o FtsZ se reorganiza em uma escada regular de anéis de divisão, formando septos de esporulação.

Com o tempo, o desaparecimento da fluorescência FtsZ nas mesmas hifas confirma a conclusão da esporulação.

Pré-aqueça a câmara ambiental a 30 graus Celsius com antecedência.

Em seguida, ligue o microscópio e o software de controle do microscópio. Coloque uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica e confirme se os filtros apropriados e espelhos diagramáticos configurados para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial, juntamente com as imagens das fusões de proteínas fluorescentes amarelas e fluorescentes vermelhas estão no lugar. Coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva e também na parte inferior da janela de imagem na placa microfluídica.

Monte cuidadosamente o dispositivo microfluídico selado no stage do microscópio invertido e prenda-o no lugar. Use os marcadores de posição incorporados para focar a janela de imagem da câmara de cultura microfluídica. Concentre-se na parte mais à esquerda da primeira câmara de fluxo rotulada como A e, em seguida, mova o estágio para o tamanho cinco do purgador, correspondendo à altura do purgador de 0,7 micrômetros.

No software microfluídico, configure o sistema para carregar células do poço de entrada oito a quatro psi por 15 segundos. Após a execução do processo, verifique a densidade celular na câmara de cultura movendo o estágio pela janela de imagem. Se nenhum esporo estiver preso, repita a etapa de carregamento celular ou, alternativamente, aumente a pressão e/ou o tempo de carregamento até que a densidade celular desejada de um a 10 esporos por janela de imagem seja alcançada.

Tome cuidado para evitar sobrecarregar a câmara de cultura. Em seguida, inicie o programa de fluxo previamente preparado no software de controle e permita que a placa microfluídica aqueça por uma hora no estágio de microscópio antes de iniciar a aquisição da imagem. No software de controle do microscópio, configure uma aquisição multidimensional para obter várias imagens em várias posições de estágio ao longo do tempo, especificando primeiro um diretório para o salvamento automático dos arquivos de imagem.

Em seguida, vá para as configurações de iluminação e insira as configurações de iluminação ideais predeterminadas para cada construção específica. Em seguida, configure uma série temporal para adquirir imagens a cada 40 minutos por 24 horas. Para determinar as posições da platina e definir o foco automático, escaneie a câmara de cultura e armazene as posições da platina para cada posição de imagem de interesse.

Certifique-se de que as posições de estágio único estejam localizadas distantes o suficiente para minimizar o branqueamento fotográfico e a toxicidade da foto. Depois que as coordenadas Z das posições de palco selecionadas forem verificadas, ative o foco automático do hardware. Em seguida, inicie o experimento de lapso de tempo no software de controle do microscópio.

Interrompa a aquisição da imagem após 24 a 30 horas, ou quando as hifas na região de interesse se diferenciarem em esporos. Em seguida, pare o programa de fluxo no software e desmonte o dispositivo microfluídico. Prepare a placa microfluídica usada para armazenamento de curto prazo, removendo qualquer meio restante dos poços de entrada, do poço de resíduos e do poço de carregamento de células.

Em seguida, encha os poços usados da pista A e os poços das pistas não utilizadas com PBS estéril. Por fim, sele a placa com filme de pêra para evitar que seque. E armazene o prato a quatro graus Celsius.