Monitoramento da infecção bacteriana e entrega de proteínas efetoras em células vegetais

Comece com uma planta experimental com regiões foliares geneticamente modificadas expressando grandes fragmentos não fluorescentes de proteína fluorescente verde superpasta ou sfGFP.

Injete essas áreas modificadas com bactérias Pseudomonas contendo proteínas efetoras marcadas com o pequeno fragmento não fluorescente de sfGFP.

Incubar para permitir a interação entre as bactérias e as células foliares.

Usando um sistema de secreção especializado, Pseudomonas entrega as proteínas efetoras marcadas no citosol da folha.

A proximidade entre os fragmentos GFP grandes e pequenos permite sua montagem em sfGFP fluorescente funcional, que então se transloca para a membrana plasmática.

Após a incubação, retire os discos das folhas das áreas injetadas.

Visualize esses discos usando um microscópio confocal de varredura a laser.

Inicialmente, obtenha imagens do disco foliar em baixa intensidade de laser para minimizar a autofluorescência. Em seguida, aumente a potência do laser para melhorar a visibilidade.

A fluorescência verde confirma a infecção bacteriana bem-sucedida e a entrega de proteína efetora nas células vegetais.

Para as folhas de Nicotiana benthamiana , infiltrar-se a suspensão de Pseudomonas na mesma área em que a Agrobacterium foi infiltrada dois dias antes.

Finalmente, corte um disco foliar das folhas inoculadas com Pseudomonas. Em pontos de tempo específicos após a infiltração de Pseudomonas, use um sistema de varredura a laser confocal para obter imagens de dois discos de folhas de dois centímetros quadrados de uma única planta. Observe as células longe do orifício de infiltração para evitar que as células mortas sejam mortas por ferimentos.

Os efetores translocados da bactéria estão presentes apenas em quantidades muito pequenas. Portanto, você pode aumentar a potência do laser e obter uma emissão de fluorescência para detectar um sinal fluorescente. No entanto, não domine para evitar a captura de sinais falsos de autofluorescência das células vegetais.