JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:37 min • September 26th, 2025
Comece com duas cepas bacterianas, uma referência e uma concorrente, cada uma expressando um marcador fluorescente distinto para identificação da cepa.
Misture as cepas em proporções iguais e coloque a mistura em um prato de ágar.
Incube a placa para permitir que as cepas cresçam e interajam.
O competidor supera a cepa de referência por meio de mecanismos dependentes ou independentes de contato.
Na competição dependente de contato, o competidor usa sistemas de secreção especializados para entregar toxinas diretamente na cepa de referência.
Na competição independente de contato, o competidor libera toxinas que se difundem no meio circundante e entram na cepa de referência.
Essas toxinas interrompem processos essenciais na cepa de referência, incluindo síntese da parede celular, replicação do DNA e síntese de proteínas, levando à interrupção do crescimento, morte celular e redução da expressão de fluorescência.
Após a incubação, examinar a placa ao microscópio de fluorescência.
A fluorescência reduzida na cepa de referência, em comparação com a fluorescência mais brilhante do concorrente, indica interações competitivas.
Para misturar a cepa de referência e a cepa concorrente em uma proporção de um para um, adicione 100 microlitros de cada cepa normalizada para OD 1.0 a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro rotulado e vórtice por um a dois segundos. Como controle, misture a cepa de referência com uma versão marcada diferencialmente de si mesma e vórtice também.
É fundamental alcançar a taxa de partida correta, pois isso pode alterar consideravelmente o resultado do experimento. Para garantir o sucesso, esta etapa pode exigir otimização para uma determinada espécie bacteriana. Depois de repetir esta etapa para cada réplica biológica, deve haver quatro réplicas biológicas com cepas de referência marcadas diferencialmente como controles e quatro réplicas biológicas com cepas de referência e concorrentes marcadas diferencialmente.
Para fazer pontos de cultura que serão usados para microscopia de fluorescência após a incubação, adicione 10 microlitros de cada controle e mistura experimental em uma placa de Petri contendo ágar LBS. Depois que as manchas secarem completamente na bancada, incube as placas a 24 graus Celsius por 24 horas.