Entrega localizada de bactérias no lúmen intestinal de uma larva de peixe-zebra usando microinjeção

Pegue um prato contendo uma larva de peixe-zebra anestesiada.

Aplique uma gota de agarose de baixo ponto de fusão sobre a larva e posicione-a suavemente lateralmente para permitir o acesso intestinal durante a injeção.

Agora, resfrie brevemente o agarose para solidificá-lo, imobilizando assim a larva.

Adicione meios contendo um agente anestésico para manter a larva sob anestesia.

Em seguida, tome uma suspensão de Clostridioides difficile marcada com fluorescência, uma bactéria patogênica, e adicione um corante traçador para facilitar o monitoramento da injeção.

Carregue esta mistura em uma agulha de microinjeção e monte a agulha em um micromanipulador.

Sob um estereomicroscópio, posicione a agulha em um ângulo direcionado para o intestino larval.

Em seguida, insira suavemente a ponta da agulha no lúmen intestinal.

Injete as bactérias diretamente no lúmen e confirme a entrega bem-sucedida usando o corante traçador. Em seguida, retraia a agulha.

Usando microscopia de fluorescência, confirme a localização de Clostridioides difficile no intestino larval.

Primeiro, coloque uma gota de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% nas larvas do peixe-zebra em uma placa de Petri para cobrir. Ajuste suavemente as larvas para uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30 a 60 segundos para permitir que a agarose de baixo ponto de fusão solidifique.

Adicione 30% de meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% de tricaína para cobrir a agarose. Para preparar a solução de injeção, adicione um microlitro de vermelho de fenol a 0,5% em solução de PBS em nove microlitros do inóculo de Clostridioides difficile corado com corante. Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um Microloader.

Monte a agulha carregada em um micromanipulador e posicione-a sob um microscópio estéreo. Ajustar a pressão de injecção entre 600 e 900 hectopascais. Defina o tempo de injeção para 0,1 a 0,3 segundos para obter 0,5 a 1,0 nanolitros.

Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de aproximadamente 45 graus, apontando para as larvas embutidas. Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal, perto do poro urogenital. Perfure a agarose e, em seguida, o músculo com a ponta da agulha.

Em seguida, insira-o no lúmen intestinal e injete 0,5 a 1,0 nanolitros de Clostridioides difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e use uma ponta flexível do Microloader para coletar as larvas injetadas adequadamente para imagens confocais.