Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:16 min. • September 26th, 2025
Comece com uma amostra de água que contenha bactérias transmitidas pela água e filtre-a para remover os detritos.
Transfira o filtrado diluído para placas de ágar com baixo teor de nutrientes, cada uma suplementada com um antibiótico específico. Espalhe o filtrado e incuba.
As bactérias portadoras de um gene específico de resistência a antibióticos crescem nas placas antibióticas correspondentes e formam colônias.
Conte as colônias para determinar as unidades formadoras de colônias (UFCs), representando o número de bactérias resistentes a antibióticos.
Selecione uma única colônia de cada placa e suspenda-a em água destilada estéril.
Aqueça a suspensão para lisar as células e liberar o conteúdo intracelular, incluindo o DNA bacteriano que contém o gene de resistência a antibióticos.
Centrifugue os tubos para separar os detritos e recolher o sobrenadante que contém o ADN.
Adicione reagentes de amplificação ao DNA extraído.
Coloque os tubos em um termociclador e execute o programa para amplificar uma região específica do DNA bacteriano.
O DNA amplificado está pronto para análise de sequência para identificar o gene de resistência a antibióticos.
Processe a amostra de água assepticamente, filtrando-a através de um pano de musselina estéril para remover qualquer partícula. Em seguida, dilua em série a amostra de água filtrada para análise posterior. Para determinar a contagem bacteriana resistente a antibióticos, adicione os antibióticos separadamente em tubos contendo 20 mililitros de ágar R2A fundido estéril modificado aproximadamente a 40 graus Celsius.
Agite para misturar uniformemente e despeje em placas de Petri estéreis antes que o ágar solidifique. Espalhe 100 microlitros de suspensão bacteriana em suas respectivas placas modificadas com ágar R2A contendo antibióticos. Incube as placas a 35 a 37 graus Celsius por 48 horas e, em seguida, determine a contagem bacteriana.
Para preparar o molde de DNA dos isolados para PCR, usando um palito de dente estéril, pegue uma única colônia pura isolada do isolado crescendo em uma placa de Petri. Suspenda a colônia bacteriana em 100 microlitros de água destilada dupla estéril em um tubo de microcentrífuga e ferva-a em banho-maria fervente ou banho seco por 10 minutos a 100 graus Celsius. Centrifugue a suspensão a 10.000 g por dois minutos para pellet os detritos e transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril fresco para usar como molde de DNA bruto.
Para amplificar a região V3 do gene 16S rRNA por PCR, prepare 40 microlitros da mistura de reação em um tubo de PCR. Coloque o tubo no bloco térmico e execute o programa apropriado no termociclador de PCR.