JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:28 min • September 26th, 2025
Pegue um tanque contendo um meio de crescimento estéril com pH ácido.
Transfira uma tela de malha com mudas de plantas para o tanque.
Sele com tampa e fita porosa para manter a esterilidade enquanto permite a troca gasosa.
Incubar com agitação para arejar o meio.
Inspecione o meio para verificar a ausência de turvação, indicando que não há contaminação bacteriana.
Localize uma amostra em uma placa de cultura e incuba-a para observar a falta de crescimento bacteriano, confirmando a ausência de bactérias contaminantes.
Inocular com Agrobacterium, um patógeno de plantas, e incubar.
As moléculas de sinalização derivadas da raiz da planta e o pH ácido ativam uma proteína sensora ligada à membrana bacteriana.
A ativação induz a expressão gênica, produzindo proteínas para fixação bacteriana às superfícies radiculares.
Após a fixação, o Agrobacterium entrega um fragmento de DNA, conhecido como DNA DE TRANSFERÊNCIA (T-DNA), para as células vegetais por meio de um sistema de secreção.
Após a integração no genoma da planta, o T-DNA sintetiza moléculas de sinalização que aumentam a colonização bacteriana.
Em uma coifa esterilizada, despeje 18 mililitros de meio MS líquido autoclavado em tanques de vidro cilíndricos estéreis com tampas estéreis.
Em seguida, use uma pinça estéril para transferir suavemente cada quadrado de malha com mudas de 10 a 14 dias da placa de Petri de meio semi-sólido para um tanque cilíndrico hidropônico. As mudas mostradas aqui são alfafa. Sele as tampas nos tanques usando fita cirúrgica porosa.
Em seguida, cultive as mudas a 22 a 24 graus Celsius com um período fotográfico de 16 horas e agitando a 50 rpm. Antes da inoculação, examine cuidadosamente o tanque com mudas para verificar se há qualquer contaminação potencial. O meio nos tanques não contaminados deve ser claro e transparente.
Se os tanques estiverem turvos com contaminação, descarte-os e numere o restante dos tanques. Amostra de 20 microlitros de meio hidropônico de cada tanque numerado e localize-o em uma placa de Petri com caldo Luria ou ágar LB. Incube o prato a 28 graus Celsius por 28 horas.
Inocule imediatamente cada tanque hidropônico numerado com 50 microlitros da suspensão de Agrobacterium tumefacians em cada tanque hidropônico numerado. Co-cultive as mudas e a bactéria A. tumefacians a 22 a 24 graus Celsius com um período fotográfico de 16 horas e agitando a 50 rpm. Examinar a placa LB manchada após 12 e 28 horas de incubação para verificar a esterilidade do meio de cultura hidropónico.
Se houver alguma contaminação, não use o tanque numerado correspondente inoculado com bactérias para outros ensaios a jusante.