Preparação de E. coli Spheroplasts

Pegue uma cultura de E. coli .

Dilua a cultura em meio fresco e incube-a para promover a divisão bacteriana.

Em seguida, dilua a cultura em meios contendo um inibidor da divisão bacteriana e incuba.

As bactérias continuam a crescer sem se dividir, formando filamentos alongados.

Transfira a cultura para um tubo novo e, em seguida, centrifugue para pellet os filamentos e remova o sobrenadante.

Lave o pellet com um estabilizador osmótico para evitar a lise do esferoplasto. Remova a solução.

Adicione tampão, lisozima, DNase e um agente quelante sequencialmente. Incubar.

O agente quelante desestabiliza a membrana externa do filamento.

A lisozima degrada a camada de peptidoglicano exposta, fazendo com que os filamentos percam a forma e formem estruturas esféricas chamadas esferoplastos.

Além disso, a DNase degrada o DNA contaminante liberado de filamentos danificados.

Adicione o estabilizador osmótico novamente, misture e incuba.

Transferir a suspensão para um tubo contendo tampão e centrifugação.

Remova o excesso de sobrenadante e ressuspenda os esferoplastos no tampão para análise a jusante.

Para configurar uma cultura durante a noite, use uma ponta de micropipeta estéril para transferir uma única