Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:13 min. • September 26th, 2025
Pegue uma cultura de Bacillus megaterium, uma bactéria gram-positiva.
Diluir a cultura em meio fresco e incubá-la com agitação para promover a divisão bacteriana.
Transfira a cultura para um tubo e centrifugue para pellet as bactérias.
Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meios contendo estabilizadores osmóticos para evitar a lise do protoplasto.
Transferir a solução ressuspensa para um balão, adicionar lisozima e incubar agitadamente.
Durante a incubação, a lisozima degrada a espessa parede celular do peptidoglicano da bactéria.
À medida que a parede celular se degrada, as bactérias mudam de uma forma em forma de bastonete para corpos esféricos delimitados apenas pela membrana plasmática, formando protoplastos.
Visualize a suspensão sob um microscópio.
As bactérias de formato redondo confirmam a formação de protoplastos, enquanto as bactérias inchadas em forma de bastonete indicam digestão incompleta.
Transfira a solução para um tubo e centrifugue para pellet os protoplastos.
Remova o sobrenadante e ressuspenda os protoplastos em meio fresco contendo estabilizadores osmóticos para análise posterior.
Para preparar protoplastos Gram-positivos de B. megaterium , dilua a cultura bacteriana durante a noite na proporção de um para 1000 em 100 mililitros de três por cento de TSB em um frasco de 250 mililitros para uma incubação de 4,5 horas a 37 graus Celsius com agitação. Quando a cultura líquida atingir uma densidade óptica de 0,9 a 1,0 a 600 nanômetros, divida a bactéria entre dois tubos cônicos de 50 mililitros para sua centrifugação e use uma pipeta siriológica para aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets em 2,5 mililitros de meio protoplasto por tubo e puxe a suspensão para um único tubo cônico para cultura em um frasco de 125 mililitros.
Adicione um mililitro de cinco miligramas por mililitro de lisozima à cultura para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com agitação. Monitorar o crescimento do protoplasto sob o microscópio óptico e observar quaisquer irregularidades, como bactérias que aparecem como bastonetes inchados em vez de esferas. No final da incubação, transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 mililitros para centrifugação e suspender novamente o pellet em cinco mililitros de meio protoplasto.
O protoplasto pode então ser armazenado a menos 20 graus Celsius por até uma semana ou até que tenham passado por três ciclos de congelamento e descongelamento.