JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 4:20 min • September 26th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo meios de crescimento pré-inoculados com bactérias produtoras de celulose.
No poço tratado, o meio é suplementado com ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA).
Sele a placa para evitar trocas gasosas e incuba.
Durante a incubação, o CEPA hidrolisa e libera etileno, uma molécula gasosa.
O etileno ativa a celulose sintase bacteriana, que utiliza a UDP-glicose citosólica para sintetizar celulose.
Com o tempo, as bactérias expulsam celulose através de sua membrana.
Isso promove a automontagem bacteriana na interface ar-líquido, formando um biofilme flutuante à base de celulose, ou película.
Após a incubação, transfira as películas para uma nova placa de vários poços. Adicione uma solução alcalina e incube a uma temperatura mais alta para lisar as células.
Remova a solução alcalina. Lave repetidamente com agitação para remover os detritos celulares enquanto retém a celulose.
Seque e pese as películas. Um maior peso seco nas amostras tratadas com CEPA em comparação com o controle indica maior produção de celulose bacteriana em resposta ao etileno.
O ensaio de película é uma ferramenta de análise padrão para a produção de celulose bacteriana. A PH e a análise morfológica são detalhadas no protocolo de texto. Na preparação, colher células de culturas iniciais em triplicado e quantificar as células usando uma câmara de contagem Petroff-Hauser.
Em seguida, prepare quatro misturas master médias com diferentes concentrações de CEPA. Para cada master mix, alíquota de 60 mililitros de meio pH 7 SH e adicione 120 microlitros de solução estoque de CEPA 0, 5, 50 ou 500 milimolares para obter concentrações finais de CEPA de 0, 0,01, 0,1 ou 1,0 milimolar. Misture esses meios girando os frascos.
Um conjunto de meios é necessário para cada um dos triplicados e um quarto conjunto é necessário para funcionar como um controle estéril. Então, divida cada preparação média de 60 mililitros em quatro alíquotas de 14 mililitros. Em seguida, pré-resfrie as alíquotas de 14 mililitros antes de inocular com suas respectivas culturas iniciais para uma concentração final de 100.000 células por mililitro.
Mantenha todos os tubos inoculados no gelo para evitar a produção de celulose. Use as alíquotas de 14 mililitros restantes para poços de controle estéreis. Agora, de cada master mix de 14 mililitros, carregue duas alíquotas de mililitros em seis poços de uma placa estéril de 24 poços para um total de quatro placas carregadas por cultura inicial analisada.
Feche cuidadosamente as placas com filme de parafina e incube-as estaticamente por sete dias a 30 graus Celsius. Para coletar uma película da placa, pressione um lado da película para elevar a borda oposta e pegue-a com uma pinça.
Em seguida, transfira individualmente as películas para os poços de uma placa de seis poços. Trate-os com 12 mililitros de hidróxido de sódio normal 0,1 a 80 graus Celsius por 20 minutos para lisar as células. Em seguida, remova o hidróxido de sódio e neutralize as películas tratadas lavando-as bem com 12 mililitros de água ultrapura por 24 horas com agitação em uma placa de seis poços.
Durante esta incubação, troque a água a cada seis horas. Quando a incubação terminar, as películas devem ser brancas. Em seguida, coloque as películas em tapetes de silicone e seque-as a 50 graus Celsius por 48 horas para prepará-las para a medição do peso seco.