Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:41 min. • September 26th, 2025
Comece com um pellet bacteriano. A bactéria contém um gene que codifica uma proteína iniciadora, mas não possui um gene de resistência a antibióticos.
Ressuspenda o pellet em água gelada para minimizar a degradação celular.
Pegue um plasmídeo carregando um gene de resistência a antibióticos e um gene alvo. Este plasmídeo é chamado de plasmídeo suicida porque não pode se replicar sem a proteína iniciadora.
Adicionar o plasmídeo à suspensão bacteriana.
Transfira a suspensão para uma cubeta gelada.
Inicie a eletroporação aplicando um pulso de alta tensão que rompe transitoriamente a membrana bacteriana, permitindo a entrada do plasmídeo.
Adicione o meio de recuperação e transfira a mistura para um tubo de cultura.
Incubar com agitação.
Pegue uma placa de ágar contendo o antibiótico e coloque a cultura em placa.
A proteína iniciadora bacteriana se liga à origem da replicação, permitindo que o plasmídeo se replique e expresse uma proteína de resistência a antibióticos.
Isso permite que as bactérias com o plasmídeo sobrevivam e cresçam, facilitando a amplificação do plasmídeo.
Pulverizar a cultura de bactérias por centrifugação a 5 000 vezes G e quatro graus Celsius durante 15 minutos. Suspenda o pellet em água destilada gelada e repita o processo de limpeza mais duas vezes.
Transferir a suspensão de bactérias para tubos de microcentrífugas e repetir a centrifugação a 14 000 vezes G e quatro graus Celsius durante cinco minutos. Depois de ressuspender o pellet em água gelada, adicione aproximadamente 3,5 microlitros da mistura de ligadura e incube no gelo por cinco minutos. Transfira o conteúdo para uma cubeta de eletroporação gelada com intervalo de dois milímetros.
Após a eletroporação, adicione o meio SOC e transfira o conteúdo para um tubo de cultura. Incubar durante uma hora a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Coloque as células transformadas em placas de ágar LB suplementadas com cloranfenicol.