Amplificação de um plasmídeo suicida em um hospedeiro bacteriano

Comece com um pellet bacteriano. A bactéria contém um gene que codifica uma proteína iniciadora, mas não possui um gene de resistência a antibióticos.

Ressuspenda o pellet em água gelada para minimizar a degradação celular.

Pegue um plasmídeo carregando um gene de resistência a antibióticos e um gene alvo. Este plasmídeo é chamado de plasmídeo suicida porque não pode se replicar sem a proteína iniciadora.

Adicionar o plasmídeo à suspensão bacteriana.

Transfira a suspensão para uma cubeta gelada.

Inicie a eletroporação aplicando um pulso de alta tensão que rompe transitoriamente a membrana bacteriana, permitindo a entrada do plasmídeo.

Adicione o meio de recuperação e transfira a mistura para um tubo de cultura.

Incubar com agitação.

Pegue uma placa de ágar contendo o antibiótico e coloque a cultura em placa.

A proteína iniciadora bacteriana se liga à origem da replicação, permitindo que o plasmídeo se replique e expresse uma proteína de resistência a antibióticos.

Isso permite que as bactérias com o plasmídeo sobrevivam e cresçam, facilitando a amplificação do plasmídeo.

Pulverizar a cultura de bactérias por centrifugação a 5 000 vezes G e quatro graus Celsius durante 15 minutos. Suspenda o p