Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Comece descongelando uma cultura congelada da população bacteriana Gram-negativa do doador e do receptor acasalados no gelo.

As células receptoras carregam transposons, segmentos curtos de DNA que incluem um gene de resistência ao antibiótico canamicina. Esses transposons são integrados aleatoriamente ao genoma do hospedeiro.

Adicione a cultura a uma placa de ágar rica em nutrientes contendo canamicina, mas sem nutrientes específicos do doador.

Adicione contas estéreis e gire suavemente o prato para espalhar a cultura uniformemente.

Remova as contas e incuba. As bactérias receptoras utilizam nutrientes, mas apenas aquelas com transposons integrados resistem à canamicina, levando à formação de colônias.

As bactérias doadoras e receptoras sem transposons não crescem.

Conte as unidades formadoras de colônias para estimar o número de bactérias receptoras com inserções de transposons exclusivas.

Adicione meios frescos e colete a população bacteriana.

Centrifugue para pellet as bactérias e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em meio com crioprotetor para preservar a viabilidade bacteriana.

Descongele uma alíquota do acasalamento congelado no gelo. Em seguida, use esferas de vidro estéreis para espalhar 150 microlitros da diluição, em cada placa de ágar Luria-Bertani de 30 por 150 milímetros, suplementada com canamicina.

Descarte o tubo usado contendo o excesso de acasalamento e incube as placas a 37 graus Celsius por 14 horas. Após a incubação, conte as unidades formadoras de colônias em cada placa para estimar o total de mutantes na biblioteca de transposons. Conte 20% de pelo menos três placas para determinar a estimativa de contagem de colônias para todo o grupo de placas.

Depois de calcular o rendimento estimado da colônia, adicione de três a cinco mililitros de LB a cada placa e raspe as bactérias usando uma ferramenta de raspagem estéril. Puxe as suspensões bacterianas de todas as placas para tubos cônicos de 50 mililitros e peletize as suspensões centrifugando a 5.000 vezes G, por sete minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cinco mililitros de LB, suplementado com glicerol a 30%.

Em seguida, faça alíquotas de um mililitro da biblioteca de transposons em criogenias e armazene-as a 80 graus Celsius negativos.