Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Comece descongelando uma cultura congelada da população bacteriana Gram-negativa do doador e do receptor acasalados no gelo.

As células receptoras carregam transposons, segmentos curtos de DNA que incluem um gene de resistência ao antibiótico canamicina. Esses transposons são integrados aleatoriamente ao genoma do hospedeiro.

Adicione a cultura a uma placa de ágar rica em nutrientes contendo canamicina, mas sem nutrientes específicos do doador.

Adicione contas estéreis e gire suavemente o prato para espalhar a cultura uniformemente.

Remova as contas e incuba. As bactérias receptoras utilizam nutrientes, mas apenas aquelas com transposons integrados resistem à canamicina, levando à formação de colônias.

As bactérias doadoras e receptoras sem transposons não crescem.

Conte as unidades formadoras de colônias para estimar o número de bactérias receptoras com inserções de transposons exclusivas.

Adicione meios frescos e colete a população bacteriana.

Centrifugue para pellet as bactérias e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em meio com crioprotetor para preservar a viabilidade bacteriana.

Descongele uma alíquota do acasalamento congelado no gelo. Em seguida, use esferas de vidro estérei