Avaliação da mortalidade induzida por bactérias patogênicas em larvas de C. elegans

Comece com uma bactéria patogênica cultivada em ágar.

Raspe as bactérias, suspenda-as em um tampão e adicione um meio para manter a viabilidade bacteriana.

Dispense a suspensão em uma microplaca.

Em seguida, pegue cepas separadas de larvas de C. elegans , com maior suscetibilidade a patógenos ou com maior resistência, e permita que elas se assentem.

Remova o sobrenadante, ressuspenda as larvas em um meio fresco e transfira-as para a microplaca contendo a bactéria.

Sele a microplaca com uma membrana permeável a gás e incuba. As bactérias secretam metabólitos tóxicos que ativam as vias de estresse e levam à morte celular.

Lave os poços para eliminar as bactérias, adicione um corante fluorescente impermeável a células e incuba.

O corante penetra apenas nas células larvais mortas com membranas rompidas e se liga aos seus ácidos nucléicos.

Lave para remover o excesso de corante e visualize os vermes corados com fluorescência para avaliar a mortalidade nas cepas suscetíveis e resistentes.

Para realizar um ensaio de morte líquida, use um raspador de células para remover a P. aeruginosa de uma placa SK e ressuspender a bactéria em aproximadamente 5 mililitros de S Basal.

Usando um espectrofotômetro,