Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:29 min. • September 26th, 2025
Comece com uma placa contendo bactérias pré-cultivadas que expressam RNA ou RNAi.
Essas bactérias carregam plasmídeos contendo um gene de resistência a antibióticos e uma inserção de gene alvo que produz RNA de fita dupla ou dsRNA para inibir a expressão gênica específica no hospedeiro.
Usando um pino estéril, transfira as colônias para uma placa de poço profundo contendo um meio suplementado com antibióticos.
Incube a placa com agitação para um crescimento bacteriano uniforme, onde os poços profundos fornecem aeração.
O antibiótico elimina as bactérias que não possuem o plasmídeo, garantindo que apenas as bactérias portadoras de plasmídeo sobrevivam.
Centrifugue a placa para separar as bactérias e descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as bactérias em uma solução salina tamponada para estabilizá-las.
Dispense as bactérias ressuspensas em uma placa de vários poços contendo meio rico em nutrientes suplementado com um antibiótico e um indutor.
O antibiótico seleciona bactérias portadoras de plasmídeo, enquanto o indutor desencadeia a expressão de dsRNA.
A placa semeada com bactérias que expressam RNAi está pronta para novos ensaios.
Para testar várias cepas bacterianas de RNAi em paralelo em um único poço de uma placa de poço de 24 poços de profundidade, inocule uma única colônia de cada clone de RNAi contendo bactérias previamente preparadas em quatro mililitros de LB suplementado com carbenicilina. Coloque as placas em uma incubadora agitada otimizada para placas de vários poços a 37 graus Celsius e 950 rpm por 16 horas, Em seguida, colete as bactérias por centrifugação a 2.000 g por 5 minutos. Transvasar o sobrenadante invertendo a placa e agitando-a vigorosamente.
Usando 100 microlitros de S Basal, ressuspenda as bactérias de RNAi. Pipetar as bactérias ressuspensas para um número adequado de alvéolos de uma placa NGM de vários poços suplementada com IPTG e carbenicilina e deixar a placa secar.