Cultura e manutenção de bactérias que expressam RNAi

Comece com uma placa contendo bactérias pré-cultivadas que expressam RNA ou RNAi.

Essas bactérias carregam plasmídeos contendo um gene de resistência a antibióticos e uma inserção de gene alvo que produz RNA de fita dupla ou dsRNA para inibir a expressão gênica específica no hospedeiro.

Usando um pino estéril, transfira as colônias para uma placa de poço profundo contendo um meio suplementado com antibióticos.

Incube a placa com agitação para um crescimento bacteriano uniforme, onde os poços profundos fornecem aeração.

O antibiótico elimina as bactérias que não possuem o plasmídeo, garantindo que apenas as bactérias portadoras de plasmídeo sobrevivam.

Centrifugue a placa para separar as bactérias e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as bactérias em uma solução salina tamponada para estabilizá-las.

Dispense as bactérias ressuspensas em uma placa de vários poços contendo meio rico em nutrientes suplementado com um antibiótico e um indutor.

O antibiótico seleciona bactérias portadoras de plasmídeo, enquanto o indutor desencadeia a expressão de dsRNA.

A placa semeada com bactérias que expressam RNAi está pronta para novos ensaios.

Para testar várias cepas bacterianas de RNAi em paralelo em um