JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:50 min • September 26th, 2025
Comece com uma placa microfluídica preenchida com um meio nutriente pré-aquecido.
Fixe a placa ao sistema coletor e vede a configuração. Conduza o meio pelos canais para remover quaisquer bolhas de ar.
Coloque a configuração em uma platina de microscópio e pré-aqueça para evitar a expansão da placa durante a geração de imagens.
Em seguida, remova o meio, introduza uma cultura bacteriana nas entradas das células e um meio indutor de estresse nas entradas da solução.
O meio indutor de estresse contém um antibiótico que interrompe a divisão celular sem inibir o aumento da massa celular.
Sele o sistema e, em seguida, inicie o carregamento celular para transferir as bactérias para a câmara de cultura da placa.
Usando luz transmitida, localize um campo de visão contendo células individuais distribuídas uniformemente.
Injete na câmara o meio indutor de estresse para expor as células ao antibiótico.
Usando o modo de contraste de fase, capture imagens de lapso de tempo para observar a formação de células filamentosas alongadas com aumento do conteúdo de DNA causado pela inibição da divisão celular mediada por antibióticos.
Primeiro, remova a solução de conservação da placa microfluídica e substitua-a por meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius, conforme descrito no Guia do usuário do software microfluídico. Conecte a placa microfluídica ao sistema coletor.
E no software microfluídico, clique no botão Selar para selar a placa para o sistema coletor. Depois disso, clique no botão Priming. Posicione a placa microfluídica com o sistema coletor no microscópio stage e pré-aqueça a 37 graus Celsius por duas horas para evitar a dilatação da câmara microfluídica.
Sele a placa microfluídica no sistema microfluídico clicando no botão Seal Off. Substitua o meio do poço oito por 150 microlitros de amostra de cultura e substitua o meio do poço um a cinco pelo meio desejado, com ou sem o reagente indutor de estresse. Sele a placa microfluídica e coloque-a no microscópio stage.
No software microfluídico, execute o procedimento de carregamento celular. Verifique se o carregamento das células é satisfatório olhando ao microscópio sob a luz transmitida. Concentre-se cuidadosamente no modo de luz transmitida e selecione vários campos de visão que mostrem bactérias isoladas e não estejam superlotadas, em torno de 10 a 20 células por 100 microlitros quadrados.
No software microfluídico, clique no botão Executar uma sequência personalizada e, em seguida, programe a injeção do meio indutor de estresse durante 10 minutos a dois PSI, seguida de injeção em um PSI pela duração desejada do tratamento de estresse. Realize imagens de microscopia no modo de lapso de tempo com um quadro a cada 10 minutos, usando contraste de fase na luz transmitida e uma fonte de luz de excitação de 560 nanômetros para o sinal mCherry, se necessário. Inicie a aquisição da imagem microscópica e o protocolo de injeção microfluídica ao mesmo tempo.