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Microbiologia
0 vistas • 3:27 min • September 26th, 2025
Comece com uma cultura de E. coli pré-tratada com um antibiótico.
Este antibiótico bloqueia a divisão celular, resultando na formação de células filamentosas alongadas com aumento do conteúdo de DNA.
Coloque uma parte da cultura em uma placa de ágar rica em nutrientes e incuba.
As células filamentosas não se dividem apesar do crescimento contínuo; apenas células não filamentosas formam colônias, resultando em baixa contagem de colônias.
Dilua a cultura bacteriana restante e adicione um corante fluorescente de ligação ao DNA. Em seguida, incube no escuro.
O corante entra nas células e se liga ao DNA.
Vortex a amostra e depois passá-la por um citômetro de fluxo.
A quantidade de luz espalhada de cada célula corresponde ao seu tamanho.
Da mesma forma, a fluorescência emitida pelos ácidos nucléicos ligados ao corante indica o conteúdo de DNA bacteriano.
As células tratadas com antibióticos mostram aumento da dispersão e fluorescência, refletindo o crescimento filamentoso e a replicação contínua do DNA sem divisão.
Isso demonstra modificações na fisiologia bacteriana causadas por antibióticos inibidores da divisão celular.
Preparar diluições seriadas de dez vezes, até 10 elevado a menos sétimo, dos 200 microlitros de amostra de cultura em meio fresco.
Misturar cada diluição por vórtice muito suave ou invertendo o tubo. Coloque 100 microlitros da diluição apropriada em placas de agarose LB não selecionadas e incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, conte o número de colônias para determinar a concentração de células viáveis em cada amostra de cultura.
Representar graficamente o UFC por mililitro em função do tempo para as culturas de células não tratadas e tratadas. Meça o OD 600 da cultura em um espectrofotômetro. Diluir a amostra de cultura com meio fresco a quatro graus Celsius para obter uma amostra com OD 600 a 0,06, correspondendo a aproximadamente 15.000 células por microlitro.
Para a coloração de DNA, misture a amostra bacteriana diluída com uma solução de 10 microgramas por mililitro de corante fluorescente de DNA na proporção de volume de um para um e incube no escuro por 15 minutos. Antes da injeção da amostra, misture a amostra por vórtice muito suave ou invertendo o tubo. Passe a amostra para o citômetro de fluxo a uma taxa de fluxo de aproximadamente 120.000 células por minuto.
Adquira luz difusa para frente e lateralmente, bem como sinal de corante fluorescente/fluorescente de DNA com as configurações apropriadas.