JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:05 min • September 26th, 2025
Um esporo bacteriano permanece dormente devido a uma camada de córtex peptidoglicano, um polímero de açúcares e aminoácidos.
Durante a germinação, o córtex se degrada para liberar açúcares no meio circundante.
Para detectar a degradação do córtex, comece com o meio que contém os açúcares liberados, coletados em pontos de tempo definidos durante a germinação dos esporos.
Utilizar como referência as concentrações crescentes de açúcares.
Os padrões e as amostras foram submetidos a um tratamento prévio para converter os açúcares em uma forma reativa.
Incube com o reagente de Ehrlich, um reagente de detecção colorimétrica que reage com açúcares e forma um complexo de cor roxa.
Transfira as misturas para uma placa multipoços e meça a absorbância dos complexos coloridos usando um leitor de microplacas.
A absorbância corresponde à intensidade da cor roxa, que é diretamente proporcional à concentração de açúcar.
Um aumento na absorbância entre as amostras de ponto de tempo indica degradação progressiva do córtex.
Gere um gráfico a partir das concentrações padrão e quantifique as concentrações da amostra.
Enquanto as amostras estão no gelo, prepare o reagente de cor. Dissolva 0,320 gramas de DMAB em 1,9 mililitros de ácido acético glacial. Observe que este reagente é sensível ao tempo, temperatura e luz e não deve ser feito com antecedência.
Depois que o DMAB se dissolver completamente, adicione 100 microlitros de ácido clorídrico 10 normal e vortex a amostra. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético glacial e vórtice novamente. Para a reação colorimétrica, transfira 100 microlitros de cada córtex resfriado ou amostra de controle para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Adicione 700 microlitros da solução colorida recém-preparada a cada amostra. Transfira imediatamente as amostras para um banho-maria a 37 graus Celsius e incube as amostras por exatamente 20 minutos. Após a incubação, transfira 200 microlitros de cada amostra para uma placa transparente de 96 poços.
As amostras devem ser de cor amarela para começar, mas mudarão para roxo se o açúcar redutor, que indica a presença de córtex, estiver presente. Aqui, muitas das amostras não mostram uma cor roxa visível. No entanto, as amostras de 250, 500 e 5.000 nanomoles parecem visualmente diferentes do nanomol zero de controle negativo.
Usando um leitor de placas, determine a absorbância em 585 nanômetros. Quando medido em um OD de 585 nanômetros, o sinal gerado a partir das amostras padrão se ajusta melhor a uma regressão linear.