JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:50 min • September 26th, 2025
Comece com uma cultura de uma espécie bacteriana que codifica proteínas recombinantes marcadas com o Peptídeo Nucleante da Vesícula, ou VNp, um peptídeo curto que promove a formação de vesículas.
Adicione um indutor à cultura e incuba. O indutor desencadeia a expressão da proteína.
O VNp se incorpora à membrana interna e promove a curvatura da membrana, encapsulando as proteínas marcadas com VNp em vesículas em brotamento.
Transfira o meio rico em vesículas para um tubo. Centrifugue-o para separar o sobrenadante rico em vesículas.
Em seguida, filtre o sobrenadante para remover os contaminantes residuais.
Em seguida, passe o filtrado por outro filtro de membrana para capturar vesículas na superfície da membrana.
Coloque a membrana em um prato e adicione solução salina tamponada com fosfato.
Retire suavemente as vesículas e transfira a suspensão para um tubo limpo.
Sonicar a suspensão para romper as membranas das vesículas e liberar as proteínas.
Centrifugar o lisado para separar os fragmentos da membrana.
O sobrenadante resultante contém proteínas recombinantes purificadas, prontas para análise.
Induza a expressão de proteínas recombinantes do promotor T7 adicionando IPTG a uma concentração final de até 20 microgramas por mililitro, ou 84 micromolares. Depois de dar tempo suficiente para a indução, pulverizar as células por centrifugação a 3000 g e 4 graus Celsius por 20 minutos. Passe o sobrenadante por um filtro PES de 0,45 mícron estéril e sem detergente para esterilizar a vesícula contendo o meio para armazenamento de longo prazo.
Para concentrar as vesículas em um volume menor, passe a vesícula estéril contendo o meio através de um filtro MCE de 0,1 mícron estéril e sem detergente. Em seguida, lave suavemente a membrana com 0,5 a 1 mililitros de solução salina tamponada com fosfato estéril, ou PBS, e use um raspador de células ou espalhador de plástico para remover cuidadosamente as vesículas da membrana. Transfira o concentrado de vesículas para um novo tubo de microcentrífuga usando uma pipeta.
As vesículas purificadas podem ser armazenadas a 4 graus Celsius. Sonicar as vesículas contendo proteínas no meio estéril usando um esquema apropriado para romper as membranas lipídicas vesiculares e liberar proteínas. Centrifugue a suspensão sonicada a 39.000 g e 4 graus Celsius por 20 minutos para remover os detritos vesiculares.