As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a transmissão sináptica através da via da fibra gigante, registrando os potenciais pós-sinápticos de um músculo longitudinal dorsal ou DLM e de um músculo tro cantoral do Togo ou TTM após estimulação direta da fibra gigante nos neurônios. Isso é feito primeiro prendendo adequadamente uma mosca anestesiada em um prato contendo um pouco de cera. O próximo passo do procedimento é inserir eletrodos de aterramento e registro estimulantes na mosca.

A etapa final do procedimento é estimular o cérebro e registrar as respostas dos músculos de salto e vôo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças nas propriedades funcionais da via da fibra gigante em função da idade do genótipo, temperatura, etc. Registrando a quantidade de tempo entre o estímulo e a resposta e contando o número de respostas bem-sucedidas após um trem de estímulos de alta frequência.

Este método pode ajudar algumas das questões-chave no campo da neurofisiologia e ajudar a examinar as propriedades funcionais das vias neuronais. Essa técnica pode ser empregada como um experimento introdutório seguido de análise genética ou molecular, ou como uma forma de avaliar propriedades fisiológicas e funcionais em animais portadores de uma mutação conhecida. A demonstração visual desse método é crítica.

Como as etapas de preparação e comprometimento levam algum tempo para serem aprendidas. As moscas são comparativamente pequenas, um certo nível de estabilidade e coordenação que precisa ser adquirido antes que os experimentos possam ser feitos corretamente. Esses experimentos usam uma configuração eletrofisiológica padrão composta por um estimulador, uma unidade de isolamento de estímulo, dois amplificadores de microeletrodos, um sistema de aquisição de dados e um computador com software de coleta.

O equipamento adicional inclui uma gaiola de Faraday, um microscópio estéreo em um suporte de lança, uma mesa de isolamento de vibração, uma fonte de luz e uma plataforma de gravação. Cinco micro manipuladores são usados. Dois micro manipuladores requerem controles finos para posicionar os eletrodos de gravação, enquanto os outros três micro manipuladores requerem apenas controles brutos.

Para posicionar os dois eletrodos de estimulação e o eletrodo de aterramento, o manipulador do eletrodo de registro DLM é colocado na extremidade final da preparação. O micro manipulador para o eletrodo de registro TTM é colocado entre o experimentador e a lateral da preparação. Os dois micro manipuladores para os eletrodos de estimulação são colocados na cabeça da preparação.

O micro manipulador para o eletrodo de aterramento é colocado no lado mais distante da preparação. Puxe microeletrodos de gravação de vidro com resistências de 40 a 60 mega ohms e guarde em um prato apoiado em cera. Use dois eletrodos de tungstênio eletromagneticamente afiados para estimulação.

Use um fio de haste ou um terceiro eletrodo fabricado eletromagneticamente. Como o terra, conecte os eletrodos estimulantes e de aterramento aos micromanipuladores antes do início da sessão experimental. Eles não precisarão ser substituídos durante a sessão.

Depois que seu equipamento estiver configurado, é hora de preparar as moscas. Anestesie as moscas resfriando-as no gelo por 10 a 15 minutos. Use uma pinça para transferir a mosca suavemente pelas pernas para um prato contendo uma plataforma de cera macia inclinada em um ângulo de aproximadamente 45 graus.

O próximo passo é prender a cera fly-in. Oriente a mosca com o lado ventral para baixo com a anterior voltada para cima na encosta. Usando uma pinça fina, estenda as pernas para fora em pares e empurre-as para dentro da cera.

Uma vez que você esteja familiarizado com a localização dos músculos a serem registrados antes de iniciar este experimento, o músculo longitudinal dorsal ou DLM e o músculo cantoral TRO turga ou TTM, os locais de fixação subcuticular do dlms correspondem à região entre a linha média torácica e as cerdas dorsais anteriores. Os locais de fixação do TTM estão localizados dorsalmente das cerdas supraalares posterior e anterior, certificando-se de que as asas não obstruam o acesso às fibras DLM ou TTM, segure as asas para fora e cole-as à cera. Usando uma pinça fina, puxe a psis para fora com cuidado e prenda-a imergindo na cera.

Esta é uma etapa crítica que requer alguma prática, pois o probos é macio e é facilmente destacado do resto da cabeça. Se isso acontecer, descarte a mosca e comece de novo. A falha em prender a cabeça dessa maneira leva a problemas ao inserir os eletrodos estimulantes pelos olhos.

Uma vez que a mosca esteja ancorada à cera, coloque a preparação sob o microscópio estéreo Dentro da gaiola de Faraday, oriente a mosca lateralmente com a cabeça da mosca à direita do experimentador. O próximo passo é inserir os eletrodos. Aproxime os eletrodos dos locais de inserção com a ajuda dos micromanipuladores para facilitar sua colocação adequada e gravações subsequentes sem olhar através do osciloscópio, abaixe o eletrodo de aterramento na extremidade posterior do abdômen usando as rodas de ajuste no micro manipulador para colocar os eletrodos estimuladores de tungstênio afiados no cérebro.

Use o micro manipulador para posicionar a ponta de um dos eletrodos, de modo que ele toque apenas um dos olhos da mosca. Faça o mesmo com o outro eletrodo, de modo que ambos os eletrodos toquem a parte externa de cada olho. Em seguida, empurre os eletrodos.

Gire através de cada olho cerca de dois a três milímetros para que as pontas dos eletrodos alcancem o cérebro situado na parte de trás da cápsula da cabeça. Os eletrodos colocados corretamente ativarão o sistema de fibra gigante para testar se os eletrodos estimulantes estão colocados corretamente. Aplique um estímulo curto de 30 a 60 volts nos eletrodos estimulantes e procure o movimento das asas e contrações dos músculos do vôo ou das pernas.

O próximo passo é preencher os microeletrodos de vidro com três molares de cloreto de potássio usando uma seringa de plástico Hamilton ou puxada por calor e colocá-los nos micromanipuladores de controle fino. Microeletrodos inseridos corretamente podem ser usados para várias rodadas de experimentos. O primeiro eletrodo de gravação será inserido em uma fibra DLM.

Existem dois DLMs bilateralmente simétricos. Cada um é composto por seis fibras musculares individuais. Os registros podem ser feitos a partir de qualquer uma das seis fibras, no entanto, as mais utilizadas são as fibras DLM 45 A e 45 B, devido à sua boa acessibilidade pelo lado dorsal da cutícula torácica, e ao fato de ambas as fibras serem inovadas pelo mesmo neurônio motor.

Usando o micro manipulador colocado na cauda do insersor de preparação, eletrodo de gravação na fibra DLM 45 A ou B no lado da mosca que está mais distante. A inclinação da plataforma permite que o eletrodo DLM entre na cutícula dorsal em um ângulo de 60 a 90 graus, o que facilita a penetração usando o software no modo osciloscópio. Olhe para o monitor do computador enquanto insere o eletrodo de gravação no tórax.

Quando o eletrodo entra em um músculo, a linha de base cai para perto ou um teste de valor negativo com um único estímulo para ver se você pode observar a resposta muscular. Insira o outro eletrodo de gravação no TTM no lado da braguilha mais próximo de você. Este eletrodo é inserido lateralmente à sua frente devido à localização do local de fixação do músculo.

Novamente, observe o monitor enquanto faz isso. Uma vez que o traço indica que o eletrodo está no teste muscular com um único estímulo para provocar uma resposta muscular. Para começar a estimular o cérebro e registrar as respostas dos músculos da perna e do vôo, aplique um estímulo de 0,03 milissegundo nos eletrodos de estimulação, começando em 30 volts e aumentando para 60 volts até observar uma contração muscular e uma despolarização das células musculares no monitor do computador.

Para o restante do experimento, defina a tensão para cinco a 10 volts acima do limite de resposta. Para medir a latência de resposta. Dê pelo menos cinco estímulos únicos com um período de descanso de cinco segundos entre cada estímulo.

Determine a frequência de seguir fornecendo trens de estímulos em taxas diferentes. Normalmente, 10 trens de 10 estímulos são administrados a 100 hertz, 200 hertz e 300 hertz permitem um período de descanso de dois segundos entre cada trem de estímulos. Esta figura mostra as respostas registradas dos TTMs e dlms após um único estímulo ao cérebro.

A latência de resposta é o tempo entre a estimulação do cérebro e a despolarização do músculo. Uma preparação saudável e uma técnica de registro adequada são indicadas por latências entre 0,7 e 1,2 milissegundos para a via G-F-T-T-M e entre 1,2 e 1,7 milissegundos para a via GF DLM. As latências podem variar com o genótipo, histórico genético, temperatura e idade, conforme mostrado aqui.

Os registros do TTM mostram mais variabilidade em termos de amplitude e forma do potencial pós-sináptico em comparação com os das grandes fibras DLM. Esse aumento da variabilidade se deve ao pequeno tamanho das fibras musculares do TTM. Essa variabilidade, no entanto, não afeta os valores de latência de resposta para a via da fibra gigante para o TTM.

Esta figura mostra a estimulação TTM e DLM a 100 hertz e 200 hertz a 100 hertz. Tanto os TTMs quanto os dlms respondem a todos os 10 estímulos a 200 hertz. As respostas TTM permanecem um para um, no entanto, as respostas DLM começam a falhar.

A razão para a falha do DLM em seguir em frequências de estimulação acima de 100 hertz é porque a sinapse química intermediária entre dois neurônios inter não tem tempo suficiente para se recuperar entre os estímulos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar a neurotransmissão através da via da fibra gigante.

Isso é feito estimulando a fibra gigante em neurônios no cérebro e, em seguida, registrando a partir de um músculo de salto e músculos de vôo no tórax.