Name: As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprenda a registrar potenciais pós-sinápticos nos músculos DLM e TTM de Drosophila melanogaster para estudar a transmissão sináptica na via da Fibra Gigante. Este método permite analisar propriedades funcionais de circuitos neuronais.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma subvenção para LP

1. Equipamentos e Materiais <ol><li> Estas experiências usam uma configuração padrão de eletrofisiologia composto por um estimulador, uma unidade de isolamento de estímulo, dois amplificadores de microeletrodos, um sistema de aquisição de dados e um computador com software de coleta. Equipamento adicional inclui uma gaiola de Faraday, um estereomicroscópio em um suporte de boom, uma mesa de isolamento de vibração, uma fonte de luz, e uma plataforma de gravação. </li><li> Cinco micromanipuladores são usados. Dois micromanipuladores exigem controles finos para posicionar os eletrodos de gravação, enquanto os outros três micromanipuladores só exigem controles bruta para posicionar os dois eletrodos de estimulação eo eletrodo terra. O micromanipulador para o eletrodo de registro DLM é colocado no fim da cauda da preparação (à esquerda do experimentador) eo micromanipulador para o eletrodo de registro TTM é colocado entre o pesquisador eo lado da preparação (um pouco à esquerda do experimentador). Os dois micromanipuladores que irá manter os eletrodos são colocados simulação na cabeça da preparação (direito de pesquisador). O micromanipulador para o eletrodo terra é colocado no lado mais distante da preparação </li><li> Puxe microeletrodos de gravação de vidro com resistências de 40-60 mohms e armazenar apartamento em um prato apoiado por cera. Para a estimulação, dois eletrodos de tungstênio eletroliticamente (NaOH) afiadas são usadas. Um fio de tungstênio, ou um terceiro eletrodo eletroliticamente fabricada é usada como um terreno. Os eletrodos estimulantes e solo são preparados e anexado ao micromanipuladores antes do início da sessão experimental e não precisa ser substituído para a duração da sessão. </li></ol> 2. Preparando o D. melanogaster <ol><li> Uma vez que seu equipamento está configurado, é hora de preparar as moscas. Anestesiar as moscas de resfriamento de gelo sobre eles ou usando CO 2. Se o CO 2 é usado, então que haja tempo suficiente (cerca de 20 minutos) para os efeitos do gás a desgastar antes do início do experimento. </li><li> Use uma pinça para transferir as moscas suavemente as pernas para um prato contendo uma plataforma de cera macia inclinada em um ângulo de aproximadamente 45 °. As próximas quatro etapas são feitas sob um microscópio de dissecação longe (mas perto), o equipamento de gravação. </li><li> O próximo passo é garantir a voar em cera. Orientar o lado ventral voar baixo, com a sua anterior cima enfrentando na encosta. Usando uma pinça fina, estender para fora das pernas, em pares, e empurrá-los para a cera. </li><li> Familiarize-se com a localização dos músculos para ser gravado a partir de: o músculo dorsal longitudinal, ou DLM, eo músculo tergotrochanteral, ou TTM. Os locais de fixação subcuticular da DLMS corresponder com a região entre a linha média dorsal do tórax e do anterior cerdas (ou cerdas). Os locais de fixação TTM estão localizados dorsalmente do posterior e anterior supra-alar cerdas. Certificando-se que as asas não obstrua o acesso ao DLM fibras ou TTM, mantenha as asas para fora e "cola"-los para a cera. </li><li> Usando um belo par de fórceps, puxar a tromba para fora com cuidado, e segura-lo por imersão na cera. Este é um passo crítico que requer alguma prática desde a tromba é macio e é facilmente retirado do resto da cabeça. Se isso acontecer, descarte a voar e começar de novo. Incapacidade de proteger a cabeça desta forma leva a problemas ao inserir os eletrodos estimulando através dos olhos. </li></ol> 3. Colocação dos eletrodos <ol><li> Uma vez que o fly está ancorada a cera, a transferência do prato com a mosca anexado abaixo do estereomicroscópio que está localizado dentro da gaiola de Faraday. Orientar a voar para os lados com a cabeça da mosca para a direita do experimentador. </li><li> O próximo passo é inserir os eletrodos. Eléctrodos de massa e estimulante pode ser inserido sem olhar através do microscópio. Boas gravações contam com empalamento precisas, por isso é uma boa idéia para a prática de manipulação do micromanipuladores. Traga os eletrodos perto dos locais de inserção com a ajuda de micromanipuladores para facilitar sua colocação adequada e gravações subseqüentes. </li><li> Abaixe o eletrodo terra na extremidade posterior do abdome utilizando as rodas de ajuste no micromanipulador. Para colocar os eletrodos de tungstênio afiadas estimulante no cérebro, use o micromanipulador para posicionar a ponta de um dos eletrodos de modo que só toca um dos olhos de mosca. Faça o mesmo com o outro para que ambos os eletrodos são apenas tocar a parte externa de cada olho. Em seguida, empurre os eletrodos, por sua vez, através de cada olho para as pontas dos eletrodos chegar ao cérebro situada na parte de trás da cápsula cefálica (cerca de 2-3mm). </li><li> Eletrodos colocados corretamente irá ativar o sistema de fibra Giant. Para testar se os eletrodos são colocados estimulando corretamente, aplique uma pequena (0,03 ms) Estímulo de 30-60 V entre os eletrodos estimulantes, e olhar para o movimento das asas e contrações do músculo do vôo / perna " </li><li> O próximo passo é preencher o back-microeletrodos de vidro com 3M KCl usando um Hamilton ou calor puxados seringa de plástico e coloque-os na micromanipuladores fine-controle. Microeletrodos inserido corretamente pode ser usado para várias rodadas de experimentos. </li><li> O eletrodo primeira gravação será inserido em uma fibra DLM. Há dois DLMS bilateralmente simétrica, cada um é composto de seis fibras musculares individuais. As gravações podem ser feitas a partir de qualquer uma das seis fibras, no entanto, os mais comumente utilizados são as fibras DLM 45a e 45b, devido à sua boa acessibilidade através do lado dorsal da cutícula torácica, eo fato de que ambas as fibras são inervadas pelo mesmo motorneuron . </li><li> Usando o micromanipulador no lado mais distante de você, inserir um eletrodo de registro em DLM fibra 45a ou b. A inclinação da plataforma permite que o eletrodo de DLM para entrar na cutícula dorsal em um ângulo de ~ 60-90, o que ajuda a penetração. Usar o software em modo osciloscópio e olhar para o monitor do computador ao inserir eletrodos de registro no tórax. Quando o eletrodo entrou um músculo da linha de base vai cair para perto de zero ou um valor negativo. Teste com um único estímulo para ver se você pode observar a resposta muscular. </li><li> Insira o eletrodo outra gravação para a TTM mais próximo de você. Este eletrodo é inserido lateralmente, na frente de você, devido à localização do local de ligação do músculo. Mais uma vez observar o monitor enquanto faz isso e teste com um único estímulo, uma vez o traço indica o eletrodo é no músculo. </li></ol> 4. Estimulação e gravação <ol><li> Agora você está pronto para começar a estimular o cérebro e as respostas de gravação da perna e músculos de vôo. Aplicar um estímulo (0,03 ms) curto através dos eletrodos estimulando a partir de 30 V e aumentando para 60 V até que você observe uma resposta (ou seja, uma contração muscular, e uma despolarização das células musculares como observado no monitor do computador). Para o restante do experimento, definir a tensão V 10/05 acima do limiar de resposta. </li><li> Para medir a latência de resposta, dar pelo menos 5 estímulos único com um período de repouso de 5 segundos entre cada estímulo. </li><li> Determinar a "freqüência de seguir", fornecendo trens de estímulos em diferentes taxas. Tipicamente de 10 trens de 10 estímulos são dados a 100Hz (10ms entre cada estímulo), 200Hz (5 ms entre cada estímulo) e 300Hz (3 ms entre cada estímulo). Permitir um período de descanso de 2 segundos entre cada trem de estímulos. </li></ol> 5. Resultados: As latências de resposta e de freqüência de seguir o Caminho de fibra gigante <ol><li> A latência de resposta é o tempo entre a estimulação do cérebro e despolarização do músculo. Este valor compara as latências de resposta para DLM e TTM a um único estímulo. Latências entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e entre 1,3 e 1,7 ms para a via GF-DLM indicam uma preparação saudável e adequada técnica de gravação. As latências podem variar com o genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade. Figura 1 (A e B). Representante traços mostrando as respostas registradas da TTMs e DLMS seguir um único estímulo aplicados ao cérebro. </li><li> Como mostrado aqui, as gravações da TTM mostram maior variabilidade em termos de amplitude e forma do potencial pós-sináptico (PSP) em relação aos das fibras DLM grande; esta variabilidade maior é devido ao pequeno tamanho das fibras musculares TTM. Esta variabilidade, entretanto, não afeta os valores de latência de resposta para a via Fiber-to-TTM Giant. Traços figura 1 (C e D). Adicional 'latência de resposta "de 4 moscas individuais, tanto para a TTM e DLM. Nota TTM variabilidade exibem traços em forma PSP, mas latência de resposta não é afetada. Para DLM há menor variabilidade na forma PSP. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Figura 1 A a D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A figura 1-D"> </li><li> Compare a "freqüência de seguir" a 100 Hz, 200 Hz e 300 Hz, calculando a proporção de respostas bem sucedidas (de 10) para ambos os DLM e vias TTM em cada freqüência de estimulação. A 100 Hz, tanto TTM e DLM siga as 01:01 estímulos. Em freqüências de estimulação acima de 100 Hz, as respostas DLM começar a mostrar falhas porque a sinapse química intermediária entre dois interneurônios não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos. As respostas TTM, no entanto, permanecem 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz. Figura 2. Vestígios Representante mostrando a "freqüência de seguir" as gravações. A 100 Hz, tanto TTMs DLMS e responder a todos os 10 estímulos (esquerda). A 200Hz, as respostas DLM começam a falhar (asterisco). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> </li></ol> 6. Resultados representante Tipo selvagem de latência curta-respostas (eletrodos estimulados são colocados nos olhos, ignorando receptores sensoriais e desencadeando o circuito GF diretamente) dependem do genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade, e variam entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e 1,3 and1.7 ms para a via GF-DLM (Tanouye e Wyman, 1980; Thomas e Wyman, 1984; Engel e Wu, 1992; Allen e Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, não publicado.) . Esta latência TTM é muito curto devido ao robusto GF-TTMn eletroquímica sinapse da via monossináptico ea latência mais DLM ocorre devido à natureza disynaptic da via, bem como a presença de uma sinapse química (PSI-DLMn). Intermediária e longa latência de respostas resultado (&gt; 3 ms) a partir da ativação dos aferentes GF e são alcançados pelo uso de um estímulo menor intensidade ou o fornecimento de um sinal ("light-off") visual. A 100Hz tanto TTM e DLM deve seguir as 1:01 estímulos. Acima de 100 Hz respostas DLM vai começar a mostrar falhas como a sinapse química entre PSI eo DLMns não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos menos de 10ms separados. TTM respostas, no entanto, permanecerá 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz (Tanouye e Wyman, 1980; Engel e Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Mutações no gene shakB, que codifica uma diferença Drosophila junção canal ("innexin"), aumentar significativamente a latência de resposta da via GF-TTM (~ 1,5 ms), enquanto o ramo GF-DLM não responde (Allen e Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). A resposta mutante pode ser restaurado, estimulando diretamente gânglios torácicos, demonstrando que o efeito retardado não é devido a interrupção da transmissão neuromuscular. A capacidade de acompanhar a estimulação de alta freqüência também é prejudicada nestes mutantes em relação ao tipo selvagem voa onde os caminhos GF-DLM e GF-TTM são geralmente capaz de seguir 10 estímulos com relação 1:1 até 100 Hz e 300 Hz, respectivamente. É importante notar que essas freqüências estão consideravelmente acima freqüências de estimulação normais recebidos pelos músculos durante o vôo contratação sustentada (10/03 Hz) (Hummon e Costello, 1989). Outro parâmetro utilizado para descrever a estabilidade das saídas GFS é o "período refratário", ou o tempo mínimo entre os pulsos de estímulo gêmeas que ainda produz duas respostas do músculo. O tempo refratário varia entre 1-4 ms para TTMs e 7-15 ms para DLMS. O período relativamente longo refratários para DLMS é devido ao relativamente lábil sinapses químicas na junção PSI-DLMn (Tanouye e Wyman, 1980; Gorczyca e Hall, 1984; Engel e Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen e Godenschwege, 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma das coisas mais importantes que é preciso prestar atenção quando tentando obter gravações de alta qualidade é a orientação correta e de saúde da preparação. Idealmente, a mosca ainda deve estar vivo no final da sessão de gravação e responsivo aos estímulos elétricos. Para os eletrodos de gravação para penetrar de forma mais eficiente o exoesqueleto torácica, a mosca deve ser colado à superfície de modo a formar um ângulo reto com os eletrodos, se necessário, a inserção dos eletrodos pode ser facilitado através da remoção de uma parte da cutícula torácica dorsal com um bisturi de tungstênio expondo assim o músculo de vôo DLM (este passo oferece uma vantagem adicional de tornar mais difícil para as pontas dos eletrodos de vidro para quebrar). Além disso, o cuidado deve ser tomado para evitar empurrar os eletrodos através do DLMS subcuticularly localizado e TTMs. A cabeça da mosca devem ser bem protegidos para permitir a eletrodos estimulantes para ser devidamente inserido no cérebro e para impedi-los de que está sendo retirado durante a sessão de gravação. Devido ao seu tamanho e bem descrita a morfologia, o GFS representa uma das vias mais acessíveis neuronal em Drosophila. A permeabilidade das sinapses elétricas a pequenas corantes marcador molecular de peso permite a visualização de neurônios eletricamente acopladas, e várias linhas disponíveis GAL4 torná-lo possível manipular os níveis de expressão de genes em um subconjunto de células ou grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Além das vantagens acima mencionadas, ambos os componentes aferentes e torácica das propriedades do circuito de exibição, como recuperação de habituação, espontânea e dishabituation, tornando o GFS Drosophila um sistema modelo conveniente para o estudo da plasticidade neuronal (Engel e Wu, , 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NOME </td><td> EMPRESA </td><td> CAT. # </td><td> COMENTÁRIOS </td></tr><tr><td> S48 Praça Pulso Stimulator </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Unidade de estimulação </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF Unidade Transformador de isolamento </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A dois canais Amplificador microeletrodos intracelulares </td><td> Ficando Instruments </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de aquisição de dados </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analógico-digital Digidata 1320 e 9,0 Axoscope software </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Plataforma de gravação com micromanipuladores manuais </td><td> Narishige, Sutter Ins., World Ins Precision. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Fonte de luz </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Selvagens estereomicroscópio M5 </td><td> Selvagens Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Mesa de isolamento de vibração </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Tubos de borosilicato para microeletrodos </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil calibre 34, 67 mm (enchimento do eletrodo) </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Ferramentas de microdissecção (fórceps, ...) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio (estéreo) </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Gaiola de Faraday </td><td> Fabricante desconhecido </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Outros: seringas de plástico, fio de terra de tungstênio e NaOH-sharpened eléctrodos de tungsténio, KCl, plataforma de cera, um PC com monitor ...

as gravações eletrofisiológicas da via fibra gigante da d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Quando assustou adulto D. melanogaster reagir pulando no ar e voar para longe. Em muitas espécies de invertebrados, incluindo D. melanogaster, a resposta do &quot;escape&quot; (ou &quot;assustar&quot;) durante o estágio adulto é mediada pelo circuito multi-componente neuronal chamado Sistema Fibra Giant (GFS). O tamanho grande comparativa dos neurônios, sua morfologia distintiva e conectividade simples fazer o GFS um sistema modelo atraente para o estudo de circuitos neuronais. A via GFS é composta de dois gigantes bilateralmente simétricos de fibra (GF) interneurônios cujos axônios descem do cérebro ao longo da linha média para o gânglio torácico por meio do conectivo cervical. No neuromere mesothoracic (T2) dos gânglios ventral a forma FG electro-química sinapses com 1) os grandes dendrite medial do motorneuron ipsilateral (TTMn) que aciona o músculo tergotrochanteral (TTM), o principal extensor para o fêmur mesothoracic / perna e 2) a sinapse perifericamente interneurônio contralateral (PSI), que por sua vez em formas químicas (colinérgicos) sinapses com o motorneurons (DLMns) dos músculos dorsal longitudinal (DLMS), os depressores asa. A via neuronal (s) para os músculos dorsovental (DVMs), os elevadores asa, ainda não foi elaborada (o DLMS e DVMs são conhecidas conjuntamente como os músculos de vôo indiretos - não estão ligados diretamente para as asas, mas sim mover o asas indiretamente por cutícula distorcer a próxima torácica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). A ativação di-sináptica da DLMS (via PSI) causa um atraso pequeno, mas importante no momento da contração desses músculos em relação à ativação monossináptico de TTM (~ 0,5 ms) permitindo que o TTMs primeiro estender o fêmur e impulsionar o voar fora da terra. O TTMs simultaneamente esticar-ativar o DLMS que por sua vez mutuamente estiramento ativar o DVMs para a duração do voo. O caminho GF pode ser ativado ou indiretamente pela aplicação de um estímulo sensorial (&quot;sopro de ar&quot; ou &quot;luzes&quot;, por exemplo), ou diretamente por um estímulo supra-limiar elétrico para o cérebro (descrito aqui). Em ambos os casos, um potencial de ação alcança o TTMs e DLMS unicamente através da FG, PSIs e TTM / DLM motoneurônios, embora o TTMns DLMns e têm outras, ainda não identificado, entradas sensoriais. Medição &quot;resposta de latência&quot; (o tempo entre o estímulo e despolarização do músculo) e &quot;a seguir para a estimulação de alta freqüência&quot; (o número de respostas de sucesso para um certo número de estímulos de alta freqüência) fornece uma maneira de reproduzível e quantitativamente avaliar o estado funcional dos componentes GFS, incluindo tanto as sinapses central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e química (glutamatérgico) junções neuromusculares (TTMn-TTM e DLMn-DLM). Ela tem sido usada para identificar genes envolvidos na formação de sinapses centrais e para avaliar a função do SNC.

O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de adulto<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Contendo os maiores neurônios na mosca. Nós descrevemos o protocolo para monitoramento da transmissão sináptica por essa via, registrando os potenciais pós-sinápticos na longitudinal dorsal (DLM) e (TTM) tergotrochanteral músculos após a estimulação direta dos interneurônios Fiber Giant.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

Quando assustados, adultos de D. melanogaster reagem saltando no ar e voando para longe. Em muitas espécies de invertebrados, incluindo D. melanogaster, a "fuga" ...

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a transmissão sináptica através da via da fibra gigante, registrando potenciais pós-sinápticos de um músculo dorsolongitudinal ou DLM e de um músculo trocantérico do tórax ou TTM após a estimulação direta da fibra gigante em neurônios. Isso é realizado primeiramente fixando adequadamente uma mosca anestesiada em uma placa contendo um pouco de cera. O próximo passo do procedimento é inserir eletrodos de estimulação, terra e registro na mosca.O passo final do procedimento é estimular o cérebro e registrar as respostas dos músculos de salto e voo. Em última análise, podem-se obter resultados que mostrem alterações nas propriedades funcionais da via de fibras gigantes em função da idade do genótipo, temperatura, entre outros fatores. Isso é feito registrando-se o intervalo de tempo entre o estímulo e a resposta, e contando-se o número de respostas bem-sucedidas após uma série de alta frequência de estímulos.Este método pode auxiliar em algumas das principais questões no campo da neurofisiologia e ajudar a examinar as propriedades funcionais das vias neuronais. Esta técnica pode ser empregada tanto como um experimento introdutório, seguido por análise genética ou molecular, quanto como uma forma de avaliar as propriedades fisiológicas e funcionais em animais portadores de uma mutação conhecida. A demonstração visual deste método é fundamental.Como os passos de preparação e indução de lesão levam algum tempo para serem aprendidos, e como as moscas são comparativamente pequenas, é necessário adquirir um certo nível de firmeza e coordenação antes que os experimentos possam ser realizados corretamente. Esses experimentos utilizam uma configuração padrão de eletrofisiologia composta por um estimulador, uma unidade de isolamento de estímulo, dois amplificadores de microeletrodos, um sistema de aquisição de dados e um computador com software de coleta.O equipamento adicional inclui uma gaiola de Faraday, um microscópio estereoscópico em um suporte articulado, uma mesa de isolamento de vibração, uma fonte de luz e uma plataforma de gravação. São utilizados cinco micromanipuladores. Dois micromanipuladores exigem controles finos para posicionar os eletrodos de gravação, enquanto os outros três micromanipuladores requerem apenas controles grossos.Para posicionar os dois eletrodos de estimulação e o eletrodo de terra, o manipulador para o eletrodo de gravação do DLM é colocado na extremidade caudal da preparação. O micro manipulador para o eletrodo de gravação do TTM é colocado entre o experimentador e o lado da preparação. Os dois micro manipuladores para os eletrodos de estimulação são colocados na extremidade cefálica da preparação.O micromanipulador para o eletrodo de terra é colocado no lado oposto da preparação. Puxe microeletrodos de gravação de vidro com resistências de 40 a 60 megaohms e armazene-os em posição plana em uma placa suportada por cera. Utilize dois eletrodos de tungstênio afiados eletromagneticamente para estimulação.Utilize um fio de haste ou um terceiro eletrodo fabricado eletromagneticamente. Como referência, conecte os eletrodos estimulador e de referência aos micromanipuladores antes do início da sessão experimental. Eles não precisarão ser substituídos durante toda a duração da sessão.Uma vez que o equipamento esteja montado, é hora de preparar as moscas. Anestesie as moscas resfriando-as em gelo por 10 a 15 minutos. Use pinças para transferir suavemente a mosca pelas pernas para uma placa contendo uma plataforma de cera macia inclinada em um ângulo de aproximadamente 45 graus.O próximo passo é fixar a mosca na cera. Posicione a mosca com o lado ventral voltado para baixo e sua extremidade anterior voltada para cima, sobre a inclinação. Usando um par de pinças finas, estenda as pernas para fora em pares e empurre-as para dentro da cera.Uma vez familiarizado com a localização dos músculos a serem registrados antes de iniciar este experimento, o músculo dorsal longitudinal (DLM) e o músculo tóraco-trocantérico (TTM), os sítios de fixação subcuticulares dos DLMs correspondem à região entre a linha média torácica e os cerdas dorsais anteriores. Os sítios de fixação do TTM localizam-se dorsalmente aos cerdas supra-alares anterior e posterior. Para garantir que as asas não obstruam o acesso às fibras do DLM ou do TTM, mantenha as asas estendidas para fora e cole-as à cera. Usando um par de pinças finas, puxe cuidadosamente o escutelo para fora e fixe-o mergulhando-o na cera.Esta é uma etapa crítica que exige alguma prática, já que a probóscide é mole e se desprende facilmente do restante da cabeça. Se isso acontecer, descarte a mosca e recomece. A falha em fixar adequadamente a cabeça dessa maneira causa problemas ao inserir os eletrodos estimuladores através dos olhos.Uma vez que a mosca esteja fixada à cera, posicione o preparo sob o microscópio estereoscópico dentro da gaiola de Faraday, orientando a mosca de lado, com a cabeça voltada para a direita do pesquisador. O próximo passo é inserir os eletrodos. Aproxime os eletrodos dos locais de inserção com a ajuda dos micromanipuladores para facilitar sua colocação adequada e as gravações subsequentes; sem olhar através do microscópio, abaixe o eletrodo de terra até a extremidade posterior do abdômen, utilizando as rodas de ajuste do micromanipulador, e posicione os eletrodos estimuladores de tungstênio afiados no cérebro.Use o micro manipulador para posicionar a ponta de um dos eletrodos, de modo que toque levemente um dos olhos da mosca. Faça o mesmo com o outro eletrodo, de forma que ambos os eletrodos toquem apenas a parte externa de cada olho. Em seguida, empurre os eletrodos para dentro.Gire cada eletrodo cerca de dois a três milímetros para que as pontas dos eletrodos alcancem o cérebro, localizado na parte traseira da cápsula cefálica. Eletrodos corretamente posicionados ativarão o sistema de fibras gigantes, permitindo verificar se os eletrodos estimuladores foram colocados adequadamente. Aplique um estímulo breve de 30 a 60 volts entre os eletrodos estimuladores e observe movimentos das asas e contrações dos músculos de voo ou das pernas.O próximo passo é preencher novamente os microeletrodos de vidro com cloreto de potássio 3 molar usando uma seringa de plástico Hamilton ou puxada a calor, e colocá-los nos micromanipuladores de controle fino. Microeletrodos corretamente inseridos podem ser usados em várias séries de experimentos. O primeiro eletrodo de registro será inserido em uma fibra A DLM.Existem dois DLMs simétricos bilateralmente. Cada um é composto por seis fibras musculares individuais. Os registros podem ser realizados em qualquer uma das seis fibras; no entanto, as fibras DLM 45 A e 45 B são as mais comumente utilizadas, devido à sua boa acessibilidade pelo lado dorsal da cutícula torácica e ao fato de ambas as fibras serem inervadas pelo mesmo neurônio motor.Usando o micromanipulador posicionado na extremidade do inseridor da preparação, introduza o eletrodo de registro na fibra DLM 45 A ou B no lado da mosca que está mais afastado. A inclinação da plataforma permite que o eletrodo DLM entre na cutícula dorsal em um ângulo de 60 a 90 graus, o que facilita a penetração utilizando o software no modo osciloscópio. Observe o monitor do computador enquanto insere o eletrodo de registro no tórax.Quando o eletrodo tiver penetrado um músculo, a linha de base cai para um valor próximo a zero ou negativo; teste com um único estímulo para verificar se é possível observar a resposta muscular. Insira o outro eletrodo de registro no músculo TTM do lado da mosca que está mais próximo de você. Esse eletrodo é inserido lateralmente à sua frente, devido à localização do local de fixação muscular.Novamente, observe o monitor enquanto realiza este procedimento. Assim que o traçado indicar que o eletrodo está no músculo, teste com um único estímulo para provocar uma resposta muscular. Para começar a estimular o cérebro e registrar respostas dos músculos da perna e das asas, aplique um estímulo de 0,03 milissegundos através dos eletrodos estimuladores, iniciando em 30 volts e aumentando até 60 volts até observar uma contração muscular e a despolarização de uma célula muscular no monitor do computador.Para o restante do experimento, ajuste a voltagem para cinco a 10 volts acima do limiar de resposta. Para medir a latência da resposta, aplique pelo menos cinco estímulos únicos com um período de repouso de cinco segundos entre cada estímulo.Determine a frequência de disparos fornecendo séries de estímulos em diferentes taxas. Normalmente, são aplicadas 10 séries de 10 estímulos a 100 hertz, 200 hertz e 300 hertz, permitindo um período de repouso de dois segundos entre cada série de estímulos. Esta figura mostra as respostas registradas dos músculos TTMs e dlms após um único estímulo aplicado ao cérebro.A latência da resposta é o tempo entre a estimulação do cérebro e a despolarização do músculo. Uma preparação saudável e uma técnica de registro adequada são indicadas por latências entre 0,7 e 1,2 milissegundos para a via G-F-T-T-M e entre 1,2 e 1,7 milissegundos para a via GF DLM. As latências podem variar conforme o genótipo, a origem genética, a temperatura e a idade, conforme mostrado aqui.Os registros provenientes do TTM mostram maior variabilidade em termos de amplitude e forma do potencial pós-sináptico em comparação com os provenientes das grandes fibras do DLM. Essa variabilidade aumentada é devida ao pequeno tamanho das fibras musculares do TTM. Essa variabilidade, no entanto, não afeta os valores de latência da resposta na via do neurônio gigante para o TTM.Esta figura mostra a estimulação de TTM e DLM a 100 hertz e 200 hertz a 100 hertz. Tanto os TTMs quanto os dlms respondem a todos os 10 estímulos a 200 hertz. As respostas de TTM permanecem um-para-um, entretanto, as respostas de DLM começam a falhar.A razão pela falha do DLM em acompanhar frequências de estimulação acima de 100 hertz é que a sinapse química intermediária entre dois interneurônios não tem tempo suficiente para se recuperar entre os estímulos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar a neurotransmissão através da via da fibra gigante.Isso é feito estimulando a fibra gigante em neurônios no cérebro e, em seguida, registrando a partir de um músculo de salto e músculos de voo no tórax.

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante

O vídeo demonstra o registro extracelular da atividade neuronal do sistema nervoso central (SNC) de larvas de Drosophila. O SNC seccionado é posicionado em uma câmara de registro e a atividade elétrica de um nervo descendente é registrada para estabelecer a frequência de disparo da linha de base. Um agente de teste é então introduzido e a mudança na frequência de disparo é registrada para determinar o efeito excitatório ou inibitório do agente.

Registro extracelular da atividade elétrica no sistema nervoso central da drosófila

Este protocolo descreve gravação extracelular das respostas potenciais de ação disparados pelos neurônios do gosto labellar em Drosophila.

Eletrofisiológica Gravação De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Prove sensilla

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Este protocolo demonstra a ablação de células a laser de neurônios individuais em larvas intactas de Drosophila . O método permite o estudo do efeito da redução da competição entre neurônios no sistema nervoso em desenvolvimento.

Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica

Aprenda a registrar potenciais pós-sinápticos nos músculos DLM e TTM de Drosophila melanogaster para estudar a transmissão sináptica na via da Fibra Gigante. Este método permite analisar propriedades funcionais de circuitos neuronais.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster

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