Triagem de inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana usando um ensaio colorimétrico

A pirofosfatase ligada à membrana bacteriana, ou mPPase, hidrolisa o pirofosfato em ortofosfato enquanto bombeia íons de sódio através da membrana.

Para avaliar os efeitos do inibidor contra mPPases, adicione concentrações crescentes de padrões de fosfato às tiras de tubos.

Introduza compostos de teste, que podem inibir a mPPase, em tubos, deixando um com água como controle.

Adicionar mPPases embebidas em lipossomas derivadas da bactéria termofílica Thermotoga maritima a todos os tubos, exceto aos padrões.

Sele e incube na temperatura ideal para ativar a enzima.

Adicione pirofosfato de sódio para iniciar a reação e liberar ortofosfato.

Transfira os tubos para uma plataforma de resfriamento para interromper a reação e centrifugue para remover a condensação.

Adicione o reagente de molibdato-ascorbato para reagir com o ortofosfato e formar o ácido fosfomolíbdico.

Adicione a solução de arsenito-citrato para reduzir o ácido, formando um complexo azul estável.

Transfira o conteúdo para uma placa multipoços e meça a absorbância.

Uma absorbância menor em comparação com o controle indica inibição da mPPase, enquanto os padrões servem como referência para a quantificação de fosfato.

Adicione um mililit