JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:04 min • October 30th, 2025
Comece com células de ameba de Dictyostelium discoideum do tipo selvagem suspensas em um tampão frio.
O tampão fornece um ambiente iônico que mantém a estabilidade da membrana.
Em seguida, adicione as células da ameba a um tubo contendo um plasmídeo com o gene alvo.
Misture suavemente a solução para colocar os plasmídeos em contato próximo com a superfície da ameba.
Transfira esta mistura para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada e execute a eletroporação.
Durante a eletroporação, os pulsos elétricos criam poros transitórios na membrana celular.
O plasmídeo entra por esses poros no citoplasma e, posteriormente, se transloca para o núcleo.
Em seguida, transfira as células da ameba para uma placa de Petri contendo um meio líquido suplementado com bactérias alimentadoras.
A ameba consome bactérias via fagocitose, fornecendo nutrientes essenciais para a recuperação celular e permitindo a expressão de plasmídeos.
As bactérias alimentadoras suportam a transfecção em células de ameba do tipo selvagem, sem a necessidade de cepas especiais que crescem sem bactérias.
Ressuspenda as células no tampão H40.
Em seguida, adicione 100 microlitros das células a um tubo contendo um a dois microgramas de DNA. Pipetar para cima e para baixo para misturar e transferir a mistura de ADN celular para uma cubeta de electroporação pré-refrigerada.
Não adicione mais de dois microgramas de DNA. Concentrações mais altas de DNA são tóxicas para as células e reduzem a eficiência.
Após a eletroporação, transfira imediatamente as células para uma placa de Petri preparada de 10 centímetros e deixe as células se recuperarem por cinco horas.