Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:01 min. • October 30th, 2025
Pegue uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho repleta de esferas de gel esféricas porosas.
Equilibre a coluna com um tampão que preserve a integridade estrutural das proteínas durante a separação.
Carregue um extrato bacteriano purificado contendo proteínas do domínio P do norovírus humano expressas recombinantemente e impurezas proteicas residuais.
Adicione o buffer para conduzir a amostra pela coluna.
Grandes impurezas residuais não podem entrar nos poros e passar pelos espaços entre as contas, eluindo primeiro.
Monitore a eluição usando absorbância UV. Um pequeno pico indica impurezas saindo da coluna.
Em contraste, as pequenas proteínas do domínio P entram nos poros do grânulo, percorrem um caminho mais longo e eluem mais tarde. Um aumento no pico de absorbância indica a eluição das proteínas do domínio P.
Colete as frações eluídas contendo as proteínas do domínio P, que agora estão prontas para análise posterior.
Lave as bombas e tubos do sistema de purificação por cromatografia líquida de alto desempenho e pré-equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel. Injete o domínio P na coluna a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto, usando um superloop ou loop, dependendo do volume da amostra concentrada. Após o término da injeção, aumente a vazão para 2,5 mililitros por minuto.
À medida que a densidade óptica aumenta e o domínio P sai da coluna, colete frações de 1,5 mililitros. O domínio P é geralmente eluído como um dímero.