Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:00 min. • October 30th, 2025
Tome uma suspensão homogênea de caseum - o material necrótico e rico em lipídios das lesões da tuberculose, que abriga micobactérias tolerantes a medicamentos em seu núcleo.
Adicione o medicamento de teste ao homogeneizado e ao vórtice para facilitar sua interação com a matriz do caseum.
Coloque uma inserção de diálise rápida contendo câmaras doadoras e receptoras separadas por uma membrana semipermeável na placa de base.
Carregue o homogenato enriquecido com drogas na câmara doadora e adicione tampão à câmara receptora.
Sele a placa e incube com rotação.
Durante a incubação, o fármaco livre se difunde através da membrana, atingindo o equilíbrio entre as duas câmaras.
Uma vez alcançado o equilíbrio, diluir a amostra doadora com tampão e a amostra receptora com homogeneizado livre de drogas para normalizar as condições da matriz para quantificação de drogas.
Finalmente, quantifique a concentração do medicamento e calcule a fração de medicamento não ligada ou fu.
O fu reflete a droga livre disponível para se difundir em caseum e atingir micobactérias tolerantes a drogas.
Adicione 6,5 microlitros do composto de teste preparado a 643,5 microlitros do homogeneizado. Para atingir a concentração final de cinco micromolares e vórtices.
Em seguida, coloque as inserções vermelhas na placa de base. Prepare as bulas para cada teste, cada composto em triplicado.
Adicione 200 microlitros da matriz enriquecida com drogas na câmara doadora vermelha de cada inserção vermelha. Em seguida, adicione 350 microlitros de PBS em cada câmara receptora.
Coloque um selo adesivo na placa e incube-o a 37 graus Celsius no misturador térmico a 200 rotações por minuto durante quatro horas. Após a incubação, misture suavemente o conteúdo das câmaras doadora e receptora pipetando para cima e para baixo duas a três vezes. Transfira 20 microlitros de homogenato de cada uma das câmaras doadoras para 20 microlitros de PBS limpo em um tubo de 1,5 mililitro.
Da mesma forma, transfira alíquotas de 20 microlitros de amostras PBS das câmaras receptoras para 20 microlitros de homogeneizado limpo.
A correspondência de matrizes elimina a necessidade de duas curvas de visão de cores separadas em homogeneizado e PBS para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar com o tempo. Misture delicadamente o conteúdo pipetando antes de remover as alíquotas.