Triagem de moduladores cíclicos de di-GMP usando bactérias que expressam uma proteína repórter fluorescente

Pegue uma placa de vários poços contendo bactérias patogênicas geneticamente modificadas cultivadas com diferentes compostos de teste, juntamente com controles negativos.

A bactéria carrega um plasmídeo com um gene que codifica a proteína fluorescente verde ou GFP.

O promotor do gene é ativado por uma proteína que responde às concentrações intracelulares cíclicas de di-GMP ou c-di-GMP.

Coloque a placa em um leitor de placas.

Use o controle negativo, que fluoresce ao máximo devido à ausência de um inibidor de c-di-GMP, para ajustar as configurações para medição ideal do sinal de fluorescência.

Se um composto de teste inibe a formação de c-di-GMP, o nível intracelular de c-di-GMP diminui.

Níveis reduzidos de c-di-GMP desencadeiam uma mudança conformacional na proteína, levando à repressão do promotor e baixa expressão de GFP, o que resulta em diminuição da fluorescência.

Meça a fluorescência e analise os dados para identificar compostos de teste que modulam os níveis intracelulares de c-di-GMP em bactérias patogênicas.

Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius para evitar condensação. Remova cuidadosamente a vedação da t