JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:07 min • October 30th, 2025
Colher amostras separadas de células vivas e mortas de Microcystis aeruginosa .
Misture as amostras para criar uma população combinada.
Microcystis contém ficocianina, um pigmento autofluorescente que permanece intacto nas células vivas, mas se degrada nas células mortas.
Vortex a amostra para quebrar os aglomerados e gerar uma suspensão uniforme de célula única.
Adicione uma sonda fluorescente de ligação a ácidos nucleicos impermeável à membrana celular e incube a amostra no escuro para evitar o fotobranqueamento.
A sonda entra seletivamente nas células mortas através de suas membranas danificadas e se liga ao DNA intracelular.
Passe a amostra por um citômetro de fluxo para medir a autofluorescência da ficocianina e a fluorescência da sonda de ácido nucleico usando lasers de comprimento de onda de excitação apropriados.
As células vivas emitem forte autofluorescência de ficocianina, mas não mostram sinal de sonda.
Em contraste, as células mortas exibem emissão reduzida de pigmento e fluorescência elevada da sonda, confirmando danos à membrana.
Isso permite a identificação das células vivas ricas em pigmento das células mortas.
Para otimizar a absorção da célula da sonda molecular, exponha metade da monocultura previamente preparada às condições apropriadas para gerar um controle morto. Verifique as variações no microambiente da amostra para confirmar a morte da cultura. E então desagregar a formação da colônia como acabamos de demonstrar.
Em seguida, selecione um laser de 488 nanômetros ao lado de um detector que pode registrar a fluorescência das sondas de ácido nucleico verde e laranja. E o laser de 640 nanômetros para registrar os sinais de ficocianina através de seus respectivos detectores.