Quantificação de unidades formadoras de colônias de bactérias associadas ao intestino em moscas Drosophila

Comece com uma microplaca contendo homogeneizados preparados a partir de moscas Drosophila . Essas moscas abrigavam uma população controlada de uma bactéria específica em seu intestino.

Os homogeneizados contêm tecidos de mosca lisados e bactérias intestinais liberadas.

Aspire as bactérias suspensas e dilua em série em várias microplacas.

Localize pequenos volumes de cada diluição em placas de ágar, garantindo que as gotículas permaneçam separadas.

Incube para permitir que as bactérias proliferem em colônias visíveis.

Capture imagens das placas para quantificar as unidades formadoras de colônias (UFCs), que representam o número de células bacterianas viáveis capazes de formar colônias individuais.

Usando um software de análise de imagem, alinhe cada imagem usando uma linha de referência, defina um limite e aplique uma grade uniforme para segmentá-la em zonas de contagem, cada uma correspondendo a um único ponto.

Ajuste o limite de brilho para distinguir colônias individuais do plano de fundo e, em seguida, execute a análise para contar colônias em cada ponto e quantificar as UFCs.

Coloque três placas retangulares de crescimento de ágar MRS com as tampas abertas no gabinete de biossegurança para secar por pelo menos 10 minutos. Prepare duas placas de diluição adicionando 100 microlitros de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços usando um pipetador de 96 canais. Carregue um rack de pontas P-20 no pipetador de 96 canais.

Fazer uma diluição de 1:10 aspirando 11,1 microlitros de homogenato da placa de amostra. Agora, dispense-o na primeira placa de diluição contendo 100 microlitros de PBS estéril por poço. Manter a placa de diluição no agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.

Misture novamente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Transferir 11,1 microlitros da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir os passos de mistura para quaisquer outras diluições. Para placas de identificação, carregue dois microlitros de cada poço no pipetador de 96 canais.

Abaixe a cabeça do pipetador lentamente sobre a placa, evitando esfaquear o ágar, e certifique-se de que todos os pontos foram dispensados. Em seguida, verifique se as manchas de líquido penetram rapidamente no ágar e não correm juntas. Repita o processo de revestimento para as placas de diluição restantes conforme descrito no manuscrito.

Assim que o líquido for completamente absorvido pelo ágar, inverta as placas e incube-as até que as colônias atinjam o tamanho ideal. Organize as placas logicamente e mantenha-as em uma ordem específica enquanto fotografa. Oriente-os de forma que A1 fique no canto superior esquerdo para todas as placas.

Depois de remover a tampa da placa, coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. Imagem das placas. Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e outros detalhes pertinentes.

Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Os nomes de arquivo que distinguem as placas tornam-se títulos de coluna para cada conjunto de contagens na planilha de saída. Crie subpastas chamadas Cortadas e Recibos na pasta.

Essas pastas receberão os arquivos de saída. Agora inicie o plugin Croptacular do ImageJ e clique em OK para iniciar o corte. Uma caixa de diálogo para escolher a pasta de origem aparecerá.

Clique em OK. Selecione a pasta de origem e clique em Abrir. Em seguida, clique em OK na caixa de diálogo para escolher o diretório de destino. Selecione a pasta de destino e pressione Abrir.

Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve ficar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem não parecer reta.

Em seguida, desenhe uma caixa de limite para a área de contagem e ajuste seu tamanho e proporção até que todos os pontos estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.

Como o plug-in pressupõe que todas as fotos estejam alinhadas de forma idêntica, certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo da primeira. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes.

A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior. Ajuste se necessário e pressione Espaço. Inicie o Count-On-It e selecione Gridiron.

Defina a intensidade da colônia limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e inferior. Torne o limite o mais rigoroso possível, enquanto ainda seleciona todas as colônias. Clique em OK na caixa de diálogo Ação necessária quando o limite for satisfatório e, em seguida, clique em OK para continuar.

Na primeira imagem, é dada a opção de prosseguir ou retornar ao menu de configuração. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta Recibos criada anteriormente.

Após a primeira imagem, as imagens a seguir terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustá-las.