Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:08 min. • November 5th, 2025
Comece com uma cultura de Neisseria gonorrhoeae cultivada em um meio empobrecido de metal.
A escassez de metal desencadeia a expressão de transportadores de membrana externa que iniciam a absorção de metal quando disponíveis.
Coloque uma membrana de nitrocelulose pré-embebida sobre papéis de filtro úmidos e monte o aparelho de mancha de pontos.
Identifique as células bacterianas e deixe o líquido absorver.
Desmonte o aparelho, remova a membrana e seque-o ao ar.
Adicione um agente de bloqueio para evitar a associação não específica.
Reinsira a membrana no aparelho, sele-a com parafilme e remonte.
Adicione um ligante de ligação de metal derivado do hospedeiro e incube com agitação.
O ligante se liga aos transportadores bacterianos.
Remova o líquido e lave a membrana para remover qualquer ligante não ligado.
Adicione um anticorpo primário específico do ligante, seguido por um anticorpo secundário conjugado com enzima e um reagente de detecção colorimétrico que forma um produto colorido.
Um sinal visível indica a expressão de transportadores de metal bacteriano sob condições limitadas por metal.
Após a incubação de duplicação de massa, diluir as culturas com três volumes de MDL. Em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius com agitação por quatro horas. Pouco antes da marca de quatro horas, corte três pedaços de papel de filtro e um pedaço de nitrocelulose no tamanho aproximado necessário para caber em um aparelho de mancha de pontos.
Mergulhe previamente a nitrocelulose em água deionizada por cerca de 10 minutos antes de montar o aparelho com papel de filtro abaixo da nitrocelulose. No final da incubação, registre as densidades celulares e padronize as densidades para uma densidade final apropriada. Em seguida, pipete as culturas de células para a nitrocelulose.
Quando o papel de filtro tiver absorvido todo o líquido, desmonte o aparelho e deixe secar a mancha. Bloquear a membrana de nitrocelulose durante uma hora com uma solução de bloqueio adequada e voltar a montar o aparelho de mancha de pontos, substituindo o papel de filtro por película de parafina para criar uma vedação à prova de fugas sob a nitrocelulose. Diluir o ligante de ligação ao metal de interesse para 0,2 micromolar no bloqueador e sondar as células durante uma hora com agitação moderada.
No final da incubação, retire o líquido com vácuo, lave a mancha e siga os procedimentos imunológicos padrão para desenvolver o sinal.