Detecção dos transportadores de metais de superfície em Neisseria gonorrhoeae usando Dot Blot

Comece com uma cultura de Neisseria gonorrhoeae cultivada em um meio empobrecido de metal.

A escassez de metal desencadeia a expressão de transportadores de membrana externa que iniciam a absorção de metal quando disponíveis.

Coloque uma membrana de nitrocelulose pré-embebida sobre papéis de filtro úmidos e monte o aparelho de mancha de pontos.

Identifique as células bacterianas e deixe o líquido absorver.

Desmonte o aparelho, remova a membrana e seque-o ao ar.

Adicione um agente de bloqueio para evitar a associação não específica.

Reinsira a membrana no aparelho, sele-a com parafilme e remonte.

Adicione um ligante de ligação de metal derivado do hospedeiro e incube com agitação.

O ligante se liga aos transportadores bacterianos.

Remova o líquido e lave a membrana para remover qualquer ligante não ligado.

Adicione um anticorpo primário específico do ligante, seguido por um anticorpo secundário conjugado com enzima e um reagente de detecção colorimétrico que forma um produto colorido.

Um sinal visível indica a expressão de transportadores de metal bacteriano sob condições limitadas por metal.

Após a incubação de duplicação de massa, diluir as culturas com três volumes de MDL. Em seguida, incube