Medindo as taxas de tradução incorreta de Mycobacterium smegmatis usando um sistema repórter GFP/luciferase

Pegue uma cultura de Mycobacterium smegmatis que abriga genes induzíveis para GFP e uma luciferase mutante marcada com sinal de secreção.

O gene mutante codifica uma luciferase inativa, mas a tradução incorreta natural durante a síntese de proteínas produz uma enzima ativa.

A GFP serve como um controle interno para normalizar a expressão da luciferase.

Adicione o indutor para iniciar a expressão gênica e, em seguida, alíquota da cultura em uma placa de vários poços.

Introduza concentrações crescentes de uma molécula de teste em poços selecionados. Incubar.

Sob condições de controle, a tradução incorreta resulta em secreção ativa de luciferase.

Se a molécula de teste inibir a tradução incorreta, a secreção ativa de luciferase diminui.

Transfira alíquotas de cultura para uma placa preta e meça a fluorescência de GFP.

Centrifugue para pellet as células.

Transfira os sobrenadantes contendo luciferase secretada e adicione o substrato, onde a luciferase ativa catalisa sua oxidação, produzindo luminescência.

Medir a luminescência e calcular a relação Luciferase/GFP; Uma proporção mais baixa indica redução do erro de tradução devido à molécula de teste.

Para começar, inocule dois mililitros de meio 7