Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:38 min. • October 30th, 2025
Pegue uma cultura de Mycobacterium smegmatis que abriga genes induzíveis para GFP e uma luciferase mutante marcada com sinal de secreção.
O gene mutante codifica uma luciferase inativa, mas a tradução incorreta natural durante a síntese de proteínas produz uma enzima ativa.
A GFP serve como um controle interno para normalizar a expressão da luciferase.
Adicione o indutor para iniciar a expressão gênica e, em seguida, alíquota da cultura em uma placa de vários poços.
Introduza concentrações crescentes de uma molécula de teste em poços selecionados. Incubar.
Sob condições de controle, a tradução incorreta resulta em secreção ativa de luciferase.
Se a molécula de teste inibir a tradução incorreta, a secreção ativa de luciferase diminui.
Transfira alíquotas de cultura para uma placa preta e meça a fluorescência de GFP.
Centrifugue para pellet as células.
Transfira os sobrenadantes contendo luciferase secretada e adicione o substrato, onde a luciferase ativa catalisa sua oxidação, produzindo luminescência.
Medir a luminescência e calcular a relação Luciferase/GFP; Uma proporção mais baixa indica redução do erro de tradução devido à molécula de teste.
Para começar, inocule dois mililitros de meio 7H9 com a cepa repórter bacteriana.
Agite a 37 graus Celsius por um a dois dias ou até que o OD a 600 nanômetros atinja a fase estacionária.
Em seguida, subcultive em 50 mililitros de meio 7H9 e cresça até que o OD a 600 nanômetros atinja a fase estacionária tardia. Antes de aliquotar as bactérias para uma placa de 96 poços, adicione ATC a uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro e misture bem.
Adicione 100 microlitros por poço a uma placa transparente de 96 poços de fundo redondo. Em seguida, adicione diferentes doses de Ksg aos poços selecionados para rastrear seus efeitos nas taxas de tradução incorreta. Adicione 200 microlitros de água estéril aos poços de borda da placa para limitar a evaporação dos poços de amostra.
Feche a placa, agite e induza as amostras a 37 graus Celsius por 16 a 20 horas. Use uma pipeta multicanal para retirar 80 microlitros de cada poço. Transfira as amostras para uma placa de 96 poços de fundo preto e meça o sinal GFP pelo luminômetro.
Depois de medir o sinal GFP, centrifugue a placa a 3.220 vezes g por 10 minutos. Em seguida, transfira 50 microlitros do sobrenadante para uma placa de fundo branco de 96 poços.
Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato Nluc a cada poço, misture bem e meça a luminescência pelo luminômetro. Finalmente, determine a razão Nluc / GFP dividindo o valor de luminescência Nluc corrigido pela fluorescência GFP.