Extração e Purificação de Plastoglóbulos de Bactérias Fotossintéticas

Comece com uma cultura de cianobactérias, que são bactérias fotossintéticas.

Essas bactérias contêm gotículas de plastoglobulos ricas em lipídios e membranas tilacóides, que são estruturas membranosas dobradas ricas em pigmentos fotossintéticos.

Centrifugue a cultura e descarte o sobrenadante para remover os polissacarídeos extracelulares produzidos por bactérias. Lave o pellet e ressuspenda-o em um tampão.

Use um homogeneizador de alta pressão para gerar força de cisalhamento, que rompe as paredes e membranas celulares.

A ruptura das membranas do tilacóide libera pigmentos fotossintéticos no lisado. A liberação de pigmento causa uma mudança de cor que indica ruptura celular e liberação de plastoglobulos.

Carregue o lisado em tubos de centrífuga e, em seguida, adicione uma solução de sacarose para formar um gradiente de densidade.

Centrifugue para separar os componentes celulares por densidade.

O tilacóide e outros componentes mais pesados se aglomeram na parte inferior, enquanto os plastoglóbulos de baixa densidade flutuam para o topo como uma banda distinta.

Colete a fração de plastoglobulos e armazene-a por congelamento para análise posterior.

Cultive 50 mililitros de cultura PCC 6802 da espécie synechocystis em meio BG11 por 7 a 10 dias para atingir a fase estacionária.

Usando um espectrofotômetro, ajuste a densidade da célula para uma densidade óptica de 2,0 a 750 nanômetros. Para remover os polissacarídeos, centrifugue 50 mililitros de cultura e remova o sobrenadante. Repita a lavagem das células em 50 mililitros de tampão A duas vezes.

Ressuspenda o pellet lavado em 25 mililitros de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 libras de polegadas quadradas. Repita o processo três vezes em condições frias até que a cor lisada mude de verde para vermelho-azul-verde sob luz branca. Retirar a alíquota do homogeneizado celular e colocá-la de lado para ser armazenada como amostra total representativa da célula.

Distribua o homogeneizado resultante em oito tubos de ultracentrífuga de três mililitros cheios até um máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Sobreponha este homogeneizado com 400 microlitros de R médio, produzindo um gradiente de degrau. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando meio R adicional conforme necessário antes de centrifugar os tubos.

O tilacóide e outras organelas mais pesadas, incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato, mostram formação de pelotas, enquanto os plastoglóbulos formam uma almofada oleosa amarela no topo ou próximo ao topo do gradiente de sacarose. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa e deposite a colheita em um tubo de dois mililitros.

Raspe os plastoglóbulos da lateral da parede do tubo de ultracentrífuga com a ponta da agulha, se necessário. Continue com o processamento de cianobactérias ou armazene plastoglóbulos brutos a 80 graus Celsius negativos e purifique mais tarde.