Cultivando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens

Pegue um tubo contendo uma cultura de Vibrio natriegens, uma bactéria de crescimento rápido.

Centrifugue a cultura para pellet as bactérias. Rejeitar o sobrenadante que contém meios residuais.

Ressuspender o sedimento bacteriano em meio fresco e transferi-lo para um balão cónico contendo o mesmo meio para a preparação da cultura bacteriana.

Incube a cultura com agitação sob condições aeradas.

Devido a um curto tempo de geração, o Vibrio natriegens utiliza nutrientes e se divide rapidamente para gerar uma população bacteriana concentrada.

Usando um espectrofotômetro, monitore regularmente a densidade óptica (DO) para determinar a concentração bacteriana.

Cultive a cultura até que a DO atinja aproximadamente um, indicando uma fase de crescimento exponencial com alta atividade metabólica.

Transfira a cultura para tubos de centrífuga.

Centrifugue a baixa temperatura para separar as bactérias, preservando a integridade celular.

Coloque o tubo no gelo e remova o sobrenadante contendo detritos celulares.

Armazene o pellet bacteriano em temperatura ultrabaixa para análise a jusante.

Para começar, lave um mililitro da cultura Vibrio natriegens durante a noite, centrifugando-a em uma centrífuga de bancada a 10.600 vezes g por um minuto.

Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender em um mililitro de meio LB-V2 fresco. Inocular um mililitro de cultura lavada durante a noite num litro de meio de cultura LB-V2 fresco num Erlenmeyer autoclavado de 4 litros com tampa estéril, de modo a obter uma relação de diluição de um a mil. Cultive a cultura a 30 graus Celsius enquanto agita a 225 RPM.

Use um espectrofotômetro para monitorar o OD 600 da cultura e, quando atingir 1,0 mais ou menos 0,2, colha a cultura centrifugando-a em dois tubos de 500 mililitros a 3.500 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius e depois coloque no gelo. Aspirar o sobrenadante e processar imediatamente o sedimento.