Preparação de Extrato de Células Brutas de Vibrio natriegens

Tome uma suspensão de Vibrio natriegens, que tem uma alta taxa de síntese de proteínas, em um tampão resfriado para evitar a degradação celular.

Centrifugue em condições frias.

Descarte o sobrenadante para remover contaminantes.

Ressuspenda o pellet em um pequeno volume de tampão resfriado.

Usando uma ponta de furo largo, transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga para evitar cisalhamento mecânico.

Misture a suspensão e coloque o tubo em um suporte posicionado sobre gelo.

Abaixe a ponta do sonicador na suspensão.

Inicie a sonicação para romper a membrana celular e liberar o conteúdo citoplasmático.

Centrifugue para separar os restos celulares insolúveis.

Coletar o extrato de células sobrenadante ou bruto contendo conteúdo citoplasmático em um tubo novo.

Congele rapidamente o extrato celular em nitrogênio líquido para preservar sua bioatividade.

Armazene em temperaturas ultrabaixas para uso posterior na expressão de proteínas livres de células.

Resfrie o tampão de lise S30 recém-preparado pH 7,7 a aproximadamente quatro graus Celsius, Use 10 mililitros deste tampão de lise S30 frio para ressuspender todos os pellets resultantes da mesma cultura de um litro e transferir a suspensão pa