Expressão de proteína livre de células usando um extrato de células brutas bacterianas

Um sistema de expressão de proteína livre de células usa um lisado de células brutas bacterianas, que contém a maquinaria molecular essencial para a transcrição e tradução in vitro.

Este lisado inclui fatores de transcrição, ribossomos e RNAs de transferência (tRNAs).

Adicione uma mistura contendo um molde de DNA, a RNA polimerase, nucleotídeos e aminoácidos ao lisado.

Transfira-o para uma placa de PCR e centrifugue para coletar o líquido grudado nas paredes. Sele a placa para evitar a evaporação.

Incube em um termociclador a uma temperatura ideal para apoiar a expressão de proteínas livres de células.

O fator de transcrição se associa à RNA polimerase para formar um complexo que se liga ao DNA molde.

Este complexo catalisa a síntese de RNA, incorporando nucleotídeos para gerar um RNA mensageiro (mRNA).

O mRNA recruta ribossomos, que iniciam a tradução, durante a qual os tRNAs entregam os aminoácidos correspondentes para formar uma cadeia polipeptídica.

O polipeptídeo se dobra em uma proteína funcional, pronta para aplicações a jusante.

Para realizar a expressão de proteínas livres de células usando o modelo de DNA, descongelamento da mistura mestre de solução de energia 10X, alíquotas de mistura mestre de aminoácidos 4X e modelo de DNA à temperatura ambiente. Em seguida, remova os estoques de RNA polimerase T7 e inibidores de RNAse do freezer de 20 graus Celsius negativos e coloque no gelo. Uma vez que o molde do ADN, a mistura mestra da solução energética 10X, e a mistura mestra do ácido aminado 4X são descongelados, coloque no gelo.

Prepare uma mistura master de reação sem células adicionando cada componente na ordem precisa a um tubo de dois mililitros no gelo e sacuda suavemente o tubo após cada adição à mistura principal. Remova o lisado de células brutas do Vibrio natriegens do freezer de 80 graus Celsius negativos e coloque no gelo por 10 a 20 minutos até descongelar. Adicionar o volume adequado de extracto bruto de células descongelado à mistura principal de reacção sem células e misturar delicadamente com uma pipeta.

Para realizar a expressão de proteína livre de células de endpoint usando termociclador, primeiro adicione 10 microlitros da mistura mestre de reação livre de células por poço do fundo de uma placa de PCR de 96 poços, certificando-se de misturar a mistura principal sacudindo o tubo suavemente entre cada transferência para a placa de PCR. Centrifugue a placa a 1.000 vezes g por 10 segundos para agrupar qualquer mistura principal que possa ter ficado presa nas laterais dos poços. Em seguida, sele os poços com um adesivo de placa para evitar a evaporação.

Coloque a placa em um termociclador ajustado a 26 graus Celsius com uma tampa aquecida a 105 graus Celsius. Depois de incubar as reações na placa de PCR por um mínimo de três horas, as proteínas expressas podem ser purificadas, quantificadas e usadas para processos a jusante.