Expressão de proteína livre de células usando um extrato de células brutas bacterianas

Um sistema de expressão de proteína livre de células usa um lisado de células brutas bacterianas, que contém a maquinaria molecular essencial para a transcrição e tradução in vitro.

Este lisado inclui fatores de transcrição, ribossomos e RNAs de transferência (tRNAs).

Adicione uma mistura contendo um molde de DNA, a RNA polimerase, nucleotídeos e aminoácidos ao lisado.

Transfira-o para uma placa de PCR e centrifugue para coletar o líquido grudado nas paredes. Sele a placa para evitar a evaporação.

Incube em um termociclador a uma temperatura ideal para apoiar a expressão de proteínas livres de células.

O fator de transcrição se associa à RNA polimerase para formar um complexo que se liga ao DNA molde.

Este complexo catalisa a síntese de RNA, incorporando nucleotídeos para gerar um RNA mensageiro (mRNA).

O mRNA recruta ribossomos, que iniciam a tradução, durante a qual os tRNAs entregam os aminoácidos correspondentes para formar uma cadeia polipeptídica.

O polipeptídeo se dobra em uma proteína funcional, pronta para aplicações a jusante.

Para realizar a expressão de proteínas livres de células usando o modelo de DNA, descongelamento da mistura mestre de solução de energia 10X, alíquotas de m