$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Injete uma cultura bacteriana projetada para tolerância ao metanol em um frasco de reagente e um meio de estresse com alta concentração de metanol em outro.
Adicione óleo a ambos e coloque-os em um sistema de cultura de microgotículas microbianas para atingir a temperatura de incubação.
Usando uma bomba, empurre os líquidos através de um chip microfluídico.
A cultura bacteriana se mistura com o meio de estresse. O óleo separa a mistura em microgotículas, que se movem para frente e para trás para o cultivo.
Inicialmente, o alto estresse com metanol retarda o crescimento bacteriano.
Com o tempo, algumas células adquirem mutações que melhoram a utilização do metanol e proliferam.
O sistema mede a densidade bacteriana e seleciona gotículas com maior crescimento.
Estes são remisturados com o meio de tensão para enriquecer para maior utilização do metanol.
Após vários ciclos, extraia gotículas com alta densidade bacteriana, espalhe-as em ágar e incuba.
Isolar e cultivar as colônias formadas em meio líquido para obter cepas adaptadas ao metanol.
Injete os volumes necessários da solução bacteriana inicial, meio fresco e óleo MMC nos frascos de reagentes esterilizados separados para a solução bacteriana inicial no meio fresco, conforme explicado anteriormente.
Para escolher a função de evolução adaptativa, clique em ALE no software. Na interface de configuração de parâmetros, ligue a chave de detecção de OD, defina todos os parâmetros descritos no manuscrito e clique na guia Iniciar para iniciar a geração de gotículas. O processo levará cerca de 25 minutos.
Durante cada período de subcultivo, observar se os valores máximos de DO das gotículas aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão de exportação de dados para exportar os dados de OD. Para extrair as gotículas alvo do MMC, clique na guia de triagem para selecionar a função de extração de gotículas.
Em seguida, escolha a opção Coletar e clique nos números de droplets alvo. Quando terminar, clique em OK. Aguarde a janela pop-up exibindo uma mensagem. Em seguida, coloque o conector rápido CF no tubo da microcentrífuga para coleta e clique em OK. Após um a dois minutos, quando a interface do software abrir uma nova janela solicitando uma mensagem, insira o conector rápido CF novamente e clique em OK para que o MMC continue a ser executado.
Quando a próxima gota alvo atingir o local de reconhecimento de gotículas, colete-a conforme especificado anteriormente. Use uma pipeta de 2,5 microlitros para retirar e colocar a gota em uma placa sólida de 90 milímetros, seguida de espalhar a gota uniformemente com uma haste de vidro revestida triangular com um comprimento lateral de três centímetros e, em seguida, cultive a gota em uma incubadora de temperatura constante de 37 graus Celsius por 72 horas. Mais tarde, escolha de três a cinco colônias independentes de bactérias para cultivar cada colônia separadamente em um frasco agitado de 50 mililitros com 10 mililitros de meio fresco em uma incubadora agitada a 200 rotações por minuto e 37 graus Celsius por 48 a 72 horas.
Após a incubação, siga os regulamentos padrão relacionados para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol.