Transformação natural e expressão de GFP na lacuna filamentosa de Cyanobacterium Phormidium

Pegue uma cultura de Phormidium lacuna, uma cianobactéria filamentosa.

Homogeneizar a cultura para dispersar os filamentos e, em seguida, centrifugar para pellet as bactérias.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meios ricos em nutrientes.

Adicione DNA de plasmídeo contendo proteína fluorescente verde e genes de resistência a antibióticos em uma placa de ágar suplementada com antibióticos.

Adicione a suspensão bacteriana sobre o DNA e incube sob condições de luz.

As bactérias internalizam o DNA usando pili tipo IV. Os genes introduzidos se integram em uma das múltiplas cópias do genoma bacteriano.

Redistribua as bactérias em uma placa de ágar suplementada com antibióticos para selecionar as bactérias transformadas.

Sob um microscópio óptico, identifique filamentos verdes saudáveis indicando uma transformação bem-sucedida.

Transfira os filamentos selecionados para meios líquidos com maior concentração de antibióticos para enriquecer a população transformada.

Novamente, coloque-os em ágar com níveis mais altos de antibióticos para segregar os transformantes.

Visualize a expressão de GFP sob um microscópio de fluorescência para confirmar a transformação bem-sucedida.

Comece inoculando 50 mililitros de meio F2 líquido em cada um dos dois frascos de 250 mililitros com um mililitro de filamentos de P. lacuna de uma cultura em execução. Cultive em luz branca sob agitação por cerca de cinco dias a 25 graus Celsius.

Após cinco dias, homogeneizar 100 mililitros de suspensão de células de P. lacuna a 10.000 RPM por três minutos e medir a densidade óptica a 750 nanômetros. Em seguida, centrifugue a suspensão celular por 15 minutos a 6.000 vezes g. Remova o sobrenadante e suspenda o pellet em 800 microlitros do líquido restante e do meio F2+ adicional. Pegue oito placas de ágar F2 + Bacto contendo 120 microgramas por mililitro de canamicina e pipete 10 microgramas de DNA no meio de cada placa de ágar.

Pipetar imediatamente 100 microlitros da suspensão celular sobre o DNA. Mantenha a placa de ágar sem tampa na bancada limpa para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 graus Celsius por dois dias.

Após dois dias, distribuir os filamentos de cada placa de ágar em várias placas de ágar Bacto F2+ frescas contendo 120 microgramas por mililitro de canamicina com uma alça de inoculação. Cultive as placas em luz branca a 25 graus Celsius e verifique as culturas regularmente ao microscópio. Após 14 a 28 dias, identifique os filamentos acastanhados mortos e procure por filamentos transformados ao microscópio.

Os filamentos transformados parecem saudáveis e verdes e são diferentes da maior parte dos filamentos. Transferir cada filamento transformado para frascos de 50 mililitros com 10 mililitros de meio F2+ com 250 microgramas por mililitro de canamicina. Cultive em luz branca a 25 graus Celsius em uma coqueteleira e observe o crescimento por até quatro semanas.

Transferir os filamentos de volta para o meio de ágar contendo 250 microgramas por mililitro de canamicina e esperar que os filamentos cresçam. Em seguida, aumente a concentração de canamicina novamente para acelerar a segregação. Para expressão de GFP, observa filamentos únicos com um microscópio de fluorescência com ampliação de 40X ou 63X e captura uma imagem de transmissão de campo claro e uma imagem de fluorescência.