Geração de mutantes marcados com antibióticos em cianobactérias por meio de recombinação homóloga

Comece com uma cultura de cianobactérias.

Centrifugue a cultura e, em seguida, lave suavemente o pellet para preservar o pili da superfície bacteriana.

Centrifugue novamente, ressuspenda o pellet em meio fresco e transfira para um tubo.

Introduzir um vetor não replicante com um gene de resistência a antibióticos. Este gene é flanqueado por sequências de DNA que são homólogas a regiões localizadas a montante e a jusante de um gene alvo no genoma bacteriano.

Incubar para permitir a internalização mediada por pili do plasmídeo, que se alinha com as sequências homólogas e substitui o gene alvo por meio da recombinação, introduzindo assim uma mutação.

Espalhe as células em ágar e incube, permitindo que o gene de resistência a antibióticos expresse uma proteína de resistência.

Cubra a superfície do ágar com ágar contendo um antibiótico e incuba. A proteína de resistência nas células mutantes inativa o antibiótico, facilitando sua sobrevivência e formação de colônias.

Escolha as colônias sobreviventes e volte a usar ágar contendo um antibiótico para segregar os mutantes resistentes a antibióticos.

Depois de preparar o meio, cepas de cianobactérias e plasmídeos, de acordo com o protocolo de texto,