Medições de fluxo de oxigênio para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas

Carregue uma suspensão de células de mamíferos em câmaras de respirômetro contendo meios e sele-as com rolhas para criar um sistema fechado para medição de oxigênio.

Um sensor dentro de cada câmara mede o fluxo de oxigênio em tempo real, a taxa de consumo de oxigênio celular.

Injete digitonina através das rolhas para permeabilizar as membranas celulares, permitindo que os componentes citosólicos se difundam.

Isso reduz a disponibilidade de substrato para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, diminuindo o fluxo de oxigênio.

Introduza piruvato e malato, que entram nas mitocôndrias e geram portadores de elétrons.

Esses portadores doam elétrons para os Complexos I e II do ETC, iniciando a transferência de elétrons e aumentando o fluxo de oxigênio.

Injete ADP para iniciar a síntese de ATP, o que eleva ainda mais o fluxo de oxigênio.

Em seguida, titule um desacoplador passo a passo para interromper o gradiente de prótons, maximizando o fluxo de oxigênio.

Finalmente, injete antimicina A para inibir o Complexo III, interrompendo o transporte de elétrons e minimizando o fluxo de oxigênio.

Esse perfil de fluxo revela a respiração mitocondrial em células permeabilizadas.

Para começar, adicione o meio de respiração mitocondrial MiR05 na câmara limpa de Oroboros. Colocar a rolha para fechar a câmara e aspirar o excesso de meio do recipiente da rolha utilizando o sistema de aspiração.

Antes de adicionar as células HEK 293T, calcule o volume de suspensão de estoque de células necessário para atingir uma concentração experimental de 1 milhão de células por mililitro.

Em seguida, remova a rolha da câmara e coloque-a na prateleira. Com uma pipeta, retirar da câmara um volume de MiR05 Vout correspondente ao volume calculado da suspensão de células.

Depois de ressuspender completamente a suspensão de estoque de células usando uma pipeta, adicione o volume calculado à câmara.

Para fechar a câmara, insira a rolha, certificando-se de que não ficam bolhas presas no interior. Retire o excesso de líquido do recipiente da rolha com o sistema de aspiração.

Aguarde a estabilização do fluxo de oxigênio, o que normalmente leva cerca de 15 minutos.

Os traços do fluxo de oxigênio são exibidos no painel superior para ambas as câmaras, enquanto a concentração de oxigênio é exibida no painel inferior.

Para preparar as microsseringas, selecione e limpe a apropriada com base no tipo de produto químico e no volume a ser titulado. Coloque a microsseringa no suporte da seringa.

Agora, carregue a seringa com o produto químico de acordo com a titulação do substrato-desacoplador-inibidor respiratório ou protocolo SUIT, evitando bolhas de gás. Encha a seringa com pelo menos 1 microlitro a mais do que o volume necessário.

Pressione o êmbolo até atingir a marca desejada no cilindro de vidro, garantindo que uma pequena gota apareça na ponta da agulha. Limpe a gota na parede do frasco para injetáveis antes de prosseguir com a titulação.

Ao realizar a titulação, a agulha deve ser inserida completamente através do capilar da rolha até que a terminação do cilindro de vidro esteja em contato com a rolha, e o produto químico deve ser injetado rapidamente na câmara.

Para iniciar este protocolo SUIT específico, adicione digitonina a uma concentração experimental de 5 microgramas por mililitro em ambas as câmaras. Em seguida, clique em OK na janela do evento para definir o evento correspondente para ambas as câmaras.

Retire o excesso de líquido do recipiente da rolha. Aguarde a estabilização do fluxo de oxigênio e registre por pelo menos 2 minutos.

Titular o piruvato em ambas as câmaras, seguido de malato, para atingir as respectivas concentrações experimentais. Clique em OK na janela do evento.

Agora, retire o excesso de líquido do recipiente da rolha, aguarde a estabilização do fluxo e registre por cerca de 2 minutos.

Em seguida, adicione ADP a uma concentração experimental de 2,5 milimolares e clique em OK na janela do evento.

Depois de limpar o excesso de líquido, aguarde a estabilização do fluxo. O fluxo pode levar até 20 minutos para se estabilizar.

Em seguida, repita o processo com CCCP em incrementos de 0,5 micromolar para atingir o fluxo máximo.

Adicione antimicina A para atingir uma concentração experimental de 2,5 micromolar.

Depois de atingir a estabilização do fluxo, clique no botão rotulado Parar medição.

Para análise de dados, mude o layout de sobreposição para câmaras separadas. Defina marcas em seções estáveis e representativas do gráfico de fluxo, evitando artefatos de titulação.

Selecione Marcas no menu superior e, em seguida, escolha Estatísticas de Marcas. Selecione a mediana no menu suspenso "modo de estatística" e clique em Copiar para a área de transferência para transferir os dados para análise posterior.