Medições de fluxo de oxigênio para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas

Carregue uma suspensão de células de mamíferos em câmaras de respirômetro contendo meios e sele-as com rolhas para criar um sistema fechado para medição de oxigênio.

Um sensor dentro de cada câmara mede o fluxo de oxigênio em tempo real, a taxa de consumo de oxigênio celular.

Injete digitonina através das rolhas para permeabilizar as membranas celulares, permitindo que os componentes citosólicos se difundam.

Isso reduz a disponibilidade de substrato para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, diminuindo o fluxo de oxigênio.

Introduza piruvato e malato, que entram nas mitocôndrias e geram portadores de elétrons.

Esses portadores doam elétrons para os Complexos I e II do ETC, iniciando a transferência de elétrons e aumentando o fluxo de oxigênio.

Injete ADP para iniciar a síntese de ATP, o que eleva ainda mais o fluxo de oxigênio.

Em seguida, titule um desacoplador passo a passo para interromper o gradiente de prótons, maximizando o fluxo de oxigênio.

Finalmente, injete antimicina A para inibir o Complexo III, interrompendo o transporte de elétrons e minimizando o fluxo de oxigênio.

Esse perfil de fluxo revela a respiração mitocondrial em células permeabilizadas.

Para começar, adicio