Expressão induzível da cadeia A da toxina ricina marcada com histidina em E. coli
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:57 min. • November 28th, 2025
Comece com colônias de E. coli contendo um gene da T7 polimerase regulada por operador lac e um plasmídeo de expressão.
O plasmídeo carrega genes de resistência a antibióticos e da cadeia da toxina ricina A.
O gene da resistência é expresso constitutivamente, produzindo uma proteína de resistência a antibióticos.
O gene RTA é marcado com histidina e regulado por um promotor T7 e um operador de lac.
Inocule as colônias em substratos suplementados com antibióticos e incube com agitação.
A proteína de resistência ao antibiótico inativa o antibiótico, permitindo o crescimento seletivo de bactérias portadoras de plasmídeos.
Transfira a cultura para um substrato suplementado com antibióticos e incube com agitação para promover o crescimento bacteriano.
Diminua a temperatura da cultura para potencializar o dobramento adequado da proteína RTA.
Adicione um indutor para aliviar a repressão de lac. Isso desencadeia a expressão da T7 polimerase, iniciando a transcrição da RTA e a síntese de proteínas.
Centrifuge para coletar as bactérias e descartar o sobrenadante.
Lave com um buffer, centrifuge e remova o sobrenadante.
Resuspenda as bactérias que expressam RTA marcadas com His em um tampão.
Comece este p
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