Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Considere uma suspensão de células bacterianas que expressam uma proteína-alvo marcada com poli-istidina.

Sonice no gelo para minimizar a degradação da proteína. Ondas sonoras de alta frequência lisam as células, liberando conteúdos intracelulares, incluindo a proteína alvo.

Centrífuga para separar detritos e transferir as proteínas contendo sobrenadante para uma seringa.

Filtre o sobrenadante para remover agregados e evitar entupimento da coluna de cromatografia.

Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade baseada em níquel e equilibre-a para uma purificação ideal de proteínas.

Carregue o filtrado na coluna. A etiqueta de polihistidina se liga a íons níquel na resina coluna, imobilizando as proteínas alvo.

Lave a coluna com um tampão para remover proteínas não ligadas e monitore a absorção UV do eluato para confirmar a remoção de proteínas não alvo.

Adicione um tampão de elução contendo imidazol, que compete com a etiqueta de polihistidina para se ligar ao níquel, liberando as proteínas.

Um segundo pico na absorção UV confirma a elução da proteína alvo, que está pronta para uso posterior.

Sonice as células no gelo usando cinco ciclos de um pulso de 15 segundos e uma pausa de 30 segundos