Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Considere uma suspensão de células bacterianas que expressam uma proteína-alvo marcada com poli-istidina.

Sonice no gelo para minimizar a degradação da proteína. Ondas sonoras de alta frequência lisam as células, liberando conteúdos intracelulares, incluindo a proteína alvo.

Centrífuga para separar detritos e transferir as proteínas contendo sobrenadante para uma seringa.

Filtre o sobrenadante para remover agregados e evitar entupimento da coluna de cromatografia.

Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade baseada em níquel e equilibre-a para uma purificação ideal de proteínas.

Carregue o filtrado na coluna. A etiqueta de polihistidina se liga a íons níquel na resina coluna, imobilizando as proteínas alvo.

Lave a coluna com um tampão para remover proteínas não ligadas e monitore a absorção UV do eluato para confirmar a remoção de proteínas não alvo.

Adicione um tampão de elução contendo imidazol, que compete com a etiqueta de polihistidina para se ligar ao níquel, liberando as proteínas.

Um segundo pico na absorção UV confirma a elução da proteína alvo, que está pronta para uso posterior.

Sonice as células no gelo usando cinco ciclos de um pulso de 15 segundos e uma pausa de 30 segundos.

Após centrifugar o lisado celular a 21.000 g e quatro graus Celsius por 15 minutos, filtre o sobrenadante usando um sistema de filtro de seringa estéril. Use um sistema automatizado de purificação, equipado com uma coluna de afinidade à base de níquel de cinco mililitros para purificar a fração de RTA marcada com HIS do supernadante estéril filtrado de E. coli. Em geral, use uma velocidade de elução de um mililitro por minuto e resfrie todo o sistema de purificação para evitar a ligação ineficiente da toxina e a perda da atividade tóxica.

Equilibre brevemente a coluna de afinidade com 20 mililitros de buffer de ligação para remover o buffer de armazenamento. Depois, aplique o sobrenadante estéril e filtrado na coluna de afinidade usando uma seringa. Lave a coluna com 25 a 35 mililitros de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas da coluna.

Realize a etapa de lavagem até que a absorção UV a 280 nanômetros esteja próxima do valor inicial de UV. Em seguida, elude a fração de RTA ligada com 20 a 35 mililitros de tampão de elução e mantenha a amostra no gelo. É importante iniciar a amostragem da fração RTA logo após o aumento do valor UV 280 e interromper a amostragem da fração RTA quando ela atingir novamente a linha base original.