Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

0 vistas2:54 min • November 28th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Considere uma suspensão de células bacterianas que expressam uma proteína-alvo marcada com poli-istidina.

Sonice no gelo para minimizar a degradação da proteína. Ondas sonoras de alta frequência lisam as células, liberando conteúdos intracelulares, incluindo a proteína alvo.

Centrífuga para separar detritos e transferir as proteínas contendo sobrenadante para uma seringa.

Filtre o sobrenadante para remover agregados e evitar entupimento da coluna de cromatografia.

Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade baseada em níquel e equilibre-a para uma purificação ideal de proteínas.

Carregue o filtrado na coluna. A etiqueta de polihistidina se liga a íons níquel na resina coluna, imobilizando as proteínas alvo.

Lave a coluna com um tampão para remover proteínas não ligadas e monitore a absorção UV do eluato para confirmar a remoção de proteínas não alvo.

Adicione um tampão de elução contendo imidazol, que compete com a etiqueta de polihistidina para se ligar ao níquel, liberando as proteínas.

Um segundo pico na absorção UV confirma a elução da proteína alvo, que está pronta para uso posterior.

Sonice as células no gelo usando cinco ciclos de um pulso de 15 segundos e uma pausa de 30 segundos.

Após centrifugar o lisado celular a 21.000 g e quatro graus Celsius por 15 minutos, filtre o sobrenadante usando um sistema de filtro de seringa estéril. Use um sistema automatizado de purificação, equipado com uma coluna de afinidade à base de níquel de cinco mililitros para purificar a fração de RTA marcada com HIS do supernadante estéril filtrado de E. coli. Em geral, use uma velocidade de elução de um mililitro por minuto e resfrie todo o sistema de purificação para evitar a ligação ineficiente da toxina e a perda da atividade tóxica.

Equilibre brevemente a coluna de afinidade com 20 mililitros de buffer de ligação para remover o buffer de armazenamento. Depois, aplique o sobrenadante estéril e filtrado na coluna de afinidade usando uma seringa. Lave a coluna com 25 a 35 mililitros de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas da coluna.

Realize a etapa de lavagem até que a absorção UV a 280 nanômetros esteja próxima do valor inicial de UV. Em seguida, elude a fração de RTA ligada com 20 a 35 mililitros de tampão de elução e mantenha a amostra no gelo. É importante iniciar a amostragem da fração RTA logo após o aumento do valor UV 280 e interromper a amostragem da fração RTA quando ela atingir novamente a linha base original.

09:54

Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Vídeos relacionados

0 Visualizações

05:35

Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Vídeos relacionados

0 Visualizações

07:19

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Vídeos relacionados

0 Visualizações

10:32

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Vídeos relacionados

0 Visualizações

07:44

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

Vídeos relacionados

0 Visualizações

02:59

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de troca aniônica: uma técnica de separação para isolar uma proteína de interesse do lisado bacteriano dialisado com base na carga líquida

Vídeos relacionados

0 Visualizações

03:54

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Vídeos relacionados

0 Visualizações

03:03

Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de anticorpos monoclonais

Vídeos relacionados

0 Visualizações

06:03

Purificação de nanopartículas de proteínas automontáveis usando cromatografia de afinidade

Vídeos relacionados

0 Visualizações

11:22

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Vídeos relacionados

0 Visualizações

Última atualização: 1 agosto 2026