Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:11 min. • November 28th, 2025
Colete uma amostra ambiental contendo células vegetativas e endosporos de uma bactéria formadora de endosporos, junto com outras bactérias.
Os endosporos possuem uma camada protetora que os ajuda a sobreviver em condições adversas.
Usando uma unidade de filtragem a vácuo, filtre a amostra para prender as células e os endosporos em uma membrana.
Coloque a membrana em um recipiente e corte em pedaços pequenos.
Transfira as peças para um tubo, adicione um tampão e agite o tubo para liberar as células e os endosporos.
Incubar com agitação em alta temperatura para enfraquecer as estruturas celulares vegetativas sem prejudicar os endosporos.
Resfrie a amostra, depois adicione a lisozima e incube com agitação. A lisozima rompe a parede celular das células vegetativas, causando sua ruptura.
Adicione hidróxido de sódio e um detergente, e incube para degradar as macromoléculas celulares e os detritos, preservando os endosporos resilientes.
Filtre a amostra para isolar os endosporos. Lave os endosporos para remover o excesso de reagentes, preparando-os para análises posteriores.
Uma vez que a unidade de filtragem e a bomba de vácuo estejam preparadas conforme o protocolo de texto, utilize pinças esterilizadas com chama de etanol para adicionar membrana de nitrocelulose estéril à unidade de filtragem. Adicione metade da amostra de sobrenadante recém-preparada na unidade de filtração de membrana e use a bomba de vácuo para coletar as células da membrana. Quando o líquido tiver passado completamente pelo filtro, pare a bomba de vácuo.
Use pinças esterilizadas para remover cuidadosamente a membrana e colocá-la em uma placa de Petri estéril. Com um novo pedaço de membrana estéril, repita a filtragem com a metade restante da solução. Para separar endosporos das células vegetativas da biomassa recém-coletada, descongelar a membrana se ela estiver congelada e usar tesouras esterilizadas com chama de etanol para cortá-la em pedaços menores.
Transfira as peças da membrana para um tubo estéril de dois mililitros e adicione 900 microlitros de buffer 1X TE. Misture cuidadosamente por meio de vórtice para liberar a biomassa da membrana. Incube o tubo a 65 graus Celsius e 80 RPM por 10 minutos.
Depois, retire o tubo da incubadora e deixe esfriar por 15 minutos. Adicione 100 microlitros de lisozima recém-preparada a uma concentração final de dois miligramas por mililitro e incube a amostra a 37 graus Celsius e 80 RPM por 60 minutos para lisar as células vegetativas. Após a conclusão da lise, adicione 250 microlitros de 3 hidróxidos de sódio normais e 250 microlitros de solução SDS a 6% à amostra. Incube em temperatura ambiente e 80 RPM por 60 minutos.
Em seguida, prepare uma unidade de filtragem estéril que segure membranas de 25 milímetros de diâmetro por autoclavagem. Após a unidade de filtragem esfriar, coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,2 micrômetro de diâmetro e 25 milímetros sobre ela.
Adicione a amostra à membrana e use a bomba de vácuo para filtrar o líquido, capturando os endosporos na membrana, enquanto o material celular vegetativo passa.