Bloqueio de replicação mediada por proteína repressora marcada fluorescente em Escherichia coli

Veja uma cultura geneticamente modificada de E. coli que expressa uma matriz operadora de tetraciclina cromossômica (tetO).

As bactérias também carregam um plasmídeo com um promotor induzível pela arabinose que impulsiona a expressão da proteína repressora tetraciclina marcada com YFP.

Transfira a cultura para um meio nutritivo enriquecido contendo antibióticos e incube com agitação para selecionar células contendo plasmídeos.

À medida que as células crescem, os respondessomos se formam e iniciam a replicação do DNA cromossômico.

Na fase exponencial, colete uma parte como controle não induzido.

Adicione arabinose, um indutor, à cultura restante e incube ambas as culturas com agitação.

Na cultura não induzida, o dímero AraC permanece ligado ao laço de DNA, inibindo a expressão do repressor.

Na cultura induzida, a arabinose se liga ao dímero AraC, induzindo a expressão do repressor.

As proteínas repressoras se ligam ao conjunto cromossômico tetO, interrompendo a progressão do garfo de replicação.

Use microscopia de fluorescência para observar ambas as culturas.

Focos fluorescentes na cultura induzida de E. coli confirmam bloqueio de replicação mediado por proteína repressora.

Uma cepa de E. col