Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:09 min. • November 28th, 2025
Veja uma cultura geneticamente modificada de E. coli que expressa uma matriz operadora de tetraciclina cromossômica (tetO).
As bactérias também carregam um plasmídeo com um promotor induzível pela arabinose que impulsiona a expressão da proteína repressora tetraciclina marcada com YFP.
Transfira a cultura para um meio nutritivo enriquecido contendo antibióticos e incube com agitação para selecionar células contendo plasmídeos.
À medida que as células crescem, os respondessomos se formam e iniciam a replicação do DNA cromossômico.
Na fase exponencial, colete uma parte como controle não induzido.
Adicione arabinose, um indutor, à cultura restante e incube ambas as culturas com agitação.
Na cultura não induzida, o dímero AraC permanece ligado ao laço de DNA, inibindo a expressão do repressor.
Na cultura induzida, a arabinose se liga ao dímero AraC, induzindo a expressão do repressor.
As proteínas repressoras se ligam ao conjunto cromossômico tetO, interrompendo a progressão do garfo de replicação.
Use microscopia de fluorescência para observar ambas as culturas.
Focos fluorescentes na cultura induzida de E. coli confirmam bloqueio de replicação mediado por proteína repressora.
Uma cepa de E. coli que transporta um conjunto de operadores de tetraciclina no plasmídeo pKM1 é usada para esse procedimento. A pKM1 codifica para TetR-YFP, uma proteína repressora de tetraciclina induzível e fluorescente amarela.
Dilua uma cultura fresca durante a noite dessa cepa de E. coli até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,01 em meio complexo diluído com antibióticos conforme necessário para a seleção. Cultive a cultura a 30 graus Celsius com agitação até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,05 a 0,1. Retire uma amostra de 10 mililitros para servir como controle não induzido.
Adicione 0,01% de arabinosa à cultura restante para induzir a produção de TetR-YFP a partir de pKM1. Continue cultivando tanto as culturas não induzidas quanto as induzidas a 30 graus Celsius com tremores. Após uma hora, verifique a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência.
Se as células induzidas forem confirmadas bloqueadas, indicado por mais de 70% das células com foco único, registre a densidade óptica e retire 7,5 mililitros da amostra para análise por eletroforese em gel bidimensional. Remova uma amostra equivalente da cultura de controle não induzida.