JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:48 min • November 28th, 2025
Pegue uma mistura mestre contendo uma DNA polimerase deslocante de fias, nucleotídeos e um corante de ligação ao DNA de fita dupla para amplificação isotérmica mediada por laço, ou LAMP.
Adicione primers que contenham uma sequência reversa-complementar específica para o gene bacteriano alvo.
Distribua a mistura master nos tubos.
Adicione amostras contendo moldes de DNA bacteriano aos tubos.
Coloque os tubos dentro de um instrumento LAMP.
A desnaturação inicial permite que o primer se ligue ao DNA-alvo.
À medida que a DNA polimerase deslocadora começa a sintetizar uma nova fita, ela desloca a fita existente, eliminando a necessidade de ciclo térmico.
O produto amplificado forma uma estrutura em loop devido ao emparelhamento reverso-complementar.
Essa estrutura contém múltiplos locais de início para o próximo ciclo, facilitando a amplificação exponencial do DNA-alvo.
O corante se liga ao DNA amplificado e emite fluorescência.
Monitore a fluorescência em tempo real para detectar a presença do gene bacteriano alvo nas amostras.
Separe fisicamente as áreas usadas para preparar a mistura LAMP Master e adicionar os moldes de DNA.
Limpe as superfícies de trabalho com isopropanol e uma solução degradante de DNA e DNase. Depois, limpe as pipetas e os suportes das tiras de tubo. Descongele a mistura master isotérmica, a mistura 10X Primer, água de grau molecular, DNA controle positivo e moldes de DNA em temperatura ambiente.
Ligue o instrumento LAMP e insira as informações relevantes da amostra. Prepare a Mistura Mestre LAMP conforme as instruções do manuscrito, faça um vórtice e centrifuge-a brevemente, e distribua 23 microlitros da Mistura Mestre em cada poço de uma tira tubular. Faça vórtice em todos os modelos de DNA e centrifuge-os brevemente.
Depois, adicione dois microlitros de molde de DNA ao poço apropriado e tampe o poço firmemente. Remova a tira do tubo do suporte e faça um movimento para garantir que todos os reagentes estejam acumulados no fundo do tubo. Carregue a fita de tubos no instrumento LAMP e inicie a execução do LAMP.
Enquanto a reação do LAMP está em andamento, toque nas abas Temperatura, Amplificação e Recozimento para ver as mudanças dinâmicas de vários parâmetros durante a execução do LAMP.