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Microbiologia
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Comece com uma cultura de Myxococcus xanthus, uma bactéria do solo de crescimento lento.
Inocule uma colônia em um meio suplementado com antibiótico.
As células foram projetadas para resistir ao antibiótico, garantindo que apenas as bactérias desejadas sobrevivam.
Transfira a suspensão para um frasco maior contendo o meio e incube com agitação para promover o crescimento ideal.
Pegue uma cobertura montada em uma estrutura metálica, que fornece suporte mecânico durante a imagem.
Dispense a cultura bacteriana sobre ele e depois adicione microsferas fluorescentes para servir como pontos de referência para o alinhamento das imagens enquanto adquire múltiplas imagens.
Coloque uma almofada de agarose pré-aquecida contendo o meio e depois a cubra com uma capa de cobertura para manter a hidratação.
Incube para permitir que as células aderam à almofada de agarose.
A almofada fornece nutrientes para as células, possibilitando a imagem de longa duração de processos celulares durante a proliferação na bactéria de crescimento lento.
Para começar, re-suspenda uma única colônia de M. xanthus em 500 microlitros de 1% de CTT, suplementado com antibióticos, em um tubo estéril e transfira toda a suspensão para um frasco Erlenmeyer de 50 mililitros contendo cinco mililitros de 1% de CTT. Prepare uma solução de microscopia de agarose a 1% contendo 0,2% de CTT misturando um grama de agarose com 80 mililitros de tampão TPM e 20 mililitros de meio CTT a 1%. Aqueça a solução no micro-ondas até que a agarose esteja derretida.
Encha uma placa de Petri com aproximadamente 60 mililitros de agarose derretida e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Pré-aqueça a almofada de agarose a 32 graus Celsius por pelo menos 15 minutos antes do uso. Em seguida, coloque uma cobertura de vidro estéril sobre uma estrutura de plástico ou metal que tenha um furo no meio. Depois, use fita adesiva para fixar a cobertura na estrutura.
Adicione de 10 a 20 microlitros de células de M. xanthus crescidas exponencialmente ao cobertor. Para adicionar microesferas fluorescentes como marcadores fiduciais das células, use o tampão TPM para diluir as microesferas a 1:100. Agite bem a suspensão do talão e adicione de cinco a dez microlitros às células.
Do almofadinha grande pré-aquecida de 1% de agarose, corte uma almofada pequena aproximadamente do tamanho da capa e coloque-a sobre as células. Depois, coloque uma cobertura sobre a almofada para evitar a evaporação e manter as células em um ambiente úmido. Incube a amostra de microscopia a 32 graus Celsius por 15 a 20 minutos para que as células se fixem no fundo da almofada de agarose antes das gravações de microscopia em time-lapse.