Avaliação da atividade bacteriana de chaperona por meio do desdobramento térmico de uma proteína modelo

Comece colocando uma cubeta em um espectrofotômetro de fluorescência equipado com um suporte e agitador de cubeta controlados por temperatura.

Adicione um tampão pré-aquecido em pH moderadamente ácido e ajuste a temperatura do suporte para simular condições de estresse.

Na amostra de teste, adicione uma chaperona protetora contra o ácido derivada de E. coli.

Na amostra de controle, adicione um volume igual de buffer.

Em seguida, introduza uma proteína do substrato sensível à temperatura e ao ácido em ambas as amostras.

Comece a monitorar a dispersão da luz.

Incubar as amostras sob condições de estresse para induzir o desdobramento do substrato.

No pH moderadamente ácido, a chaperona se torna ativa e estabiliza a proteína não dobrada.

Adicione uma solução salina neutralizadora de pH e continue registrando a dispersão da luz.

Na amostra controle, o retorno ao pH neutro faz com que a proteína não dobrada se agrege, aumentando a dispersão da luz.

Na amostra testada, a chaperona promove o redobramento do substrato, o que reduz a dispersão da luz em comparação ao controle.

Compare os sinais de espalhamento da luz para avaliar a atividade dos acompanhantes.

Coloque uma cubeta de quartzo de um mililitro em um espectrofotômetro de fluorescência equipado com suportes e agitadores de amostras controlados por temperatura.

Ajuste o comprimento de onda de excitação e emissão para 350 nanômetros. Adicione os volumes apropriados de tampão D pré-aquecido nos valores de pH desejados à cuvetta. O volume total é de 1.000 microlitros.

Ajuste a temperatura no suporte da cuveta para 43 graus Celsius. Adicione 12,5 micromolares HdeB ao buffer, seguido pela adição de 0,5 micromolar MDH. Comece a monitorar a dispersão da luz.

Incube a reação por 360 segundos para permitir o desdobramento suficiente do MDH. Eleve o pH para sete adicionando um volume de 0,16 a 0,34 de fosfato de dipotássio não tamponado em dois molares e continue registrando a dispersão da luz por mais 440 segundos. Analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.