Avaliação da atividade bacteriana de chaperona por meio do desdobramento térmico de uma proteína modelo

Comece colocando uma cubeta em um espectrofotômetro de fluorescência equipado com um suporte e agitador de cubeta controlados por temperatura.

Adicione um tampão pré-aquecido em pH moderadamente ácido e ajuste a temperatura do suporte para simular condições de estresse.

Na amostra de teste, adicione uma chaperona protetora contra o ácido derivada de E. coli.

Na amostra de controle, adicione um volume igual de buffer.

Em seguida, introduza uma proteína do substrato sensível à temperatura e ao ácido em ambas as amostras.

Comece a monitorar a dispersão da luz.

Incubar as amostras sob condições de estresse para induzir o desdobramento do substrato.

No pH moderadamente ácido, a chaperona se torna ativa e estabiliza a proteína não dobrada.

Adicione uma solução salina neutralizadora de pH e continue registrando a dispersão da luz.

Na amostra controle, o retorno ao pH neutro faz com que a proteína não dobrada se agrege, aumentando a dispersão da luz.

Na amostra testada, a chaperona promove o redobramento do substrato, o que reduz a dispersão da luz em comparação ao controle.

Compare os sinais de espalhamento da luz para avaliar a atividade dos acompanhantes.

Coloque uma cubeta de quartzo de um mililit