Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:46 min. • November 28th, 2025
Veja culturas recombinantes de E. coli sensíveis ao estresse ambiental.
A cultura de teste carrega um plasmídeo codificando uma chaperona ativada por ácido, enquanto a cultura controle carrega apenas a espinha dorsal do plasmídeo.
Inocular colônias individuais em meios suplementados com antibióticos para garantir a retenção de plasmídeos e incubar para promover o crescimento bacteriano.
Dilua as culturas em meio fresco contendo o antibiótico e um indutor para ativar a expressão de chaperonas.
Cultive as culturas até a fase média logaritaritharitma e depois dilua para alcançar uma densidade óptica específica.
Adicione ácido para baixar o pH, induzindo estresse ácido.
Na cultura testada, condições ácidas ativam a chaperona, que estabiliza as proteínas celulares e impede sua agregação. Na cultura controle, a ausência do chaperone faz com que as proteínas celulares se desnaturalizem e se agreguem.
Adicione uma base para neutralizar o pH e parar o estresse ácido.
Monitore o crescimento bacteriano medindo a densidade óptica ao longo do tempo.
O aumento do crescimento na cultura testada indica o papel protetor do acompanhante durante o estresse ácido.
Prepare uma cultura durante a noite em 50 mililitros de LB com ampicilina e cultive as células a 200 RPM e 30 graus Celsius. Dilua culturas durante a noite 40 vezes em 25 mililitros de LB com ampicilina.
Faça crescer as bactérias na presença de 0,5% de arabinose a 30 graus Celsius e 200 RPM até uma densidade óptica de 600 nanômetros, ou OD600 igual a 1,0, para induzir a expressão da proteína HDEB. Para os experimentos de mudança de pH, use LB com Ampicilina e arabinose para diluir as células até um OD600 de 0,5. Ajuste aos respectivos valores de pH adicionando volumes apropriados de ácido clorídrico de cinco molares.
Após os pontos de tempo indicados, neutralize as culturas adicionando os volumes apropriados de hidróxido de sódio de cinco molares. Monitore o crescimento das culturas neutralizadas e da cultura líquida por 12 horas a 30 graus Celsius usando medições de OD.