Extração de DNA Genômico de Tecido Foliar Vegetal Infectado por Bactérias Patogênicas

Pegue uma folha infectada com Candidatus liberibacter, uma bactéria patogênica.

Corte em pedaços, congele rapidamente em nitrogênio líquido e moa para romper as células da planta e liberar seu conteúdo, incluindo as bactérias.

Adicione um buffer de lisão de núcleos e misture bem.

Incubar em alta temperatura para lisar as membranas, liberando DNA genômico dos núcleos das plantas e das células bacterianas.

Adicione a enzima RNase, inverta o tubo para misturar e incube para degradar o RNA.

Adicione uma solução de precipitação de proteínas e misture para promover a agregação de proteínas. Centrífuga para pellet de proteína e detritos celulares.

Transfira o sobrenadante para um tubo contendo isopropanol e misture para precipitar o DNA em fitas visíveis. Centrifuge para fazer pellets no DNA.

Lave o pellet com etanol para remover impurezas, seque ao ar livre e reidrate o DNA.

Incube em alta temperatura para solubilizar o DNA, depois coloque uma amostra em um microcubeta.

Usando um espectrofotômetro, meça a concentração isolada de DNA.

Primeiro, use uma tesoura limpa para cortar uma folha inteira fresca de uma árvore cítrica e coloque em um saco plástico limpo para sanduíches. Depois, resfrie um pilão adicionando uma pequena quantidade de nitrogênio líquido. Em seguida, use a tesoura para cortar pequenos pedaços do tecido foliar, com aproximadamente uma polegada quadrada de tamanho.

Coloque os pedaços de folha no almofariz para congelá-los imediatamente. Comece rapidamente a triturar o tecido foliar com o almofariz até que o nitrogênio líquido evapore e fique um pó verde fino. Em seguida, resfrie uma espátula de metal em nitrogênio líquido por 10 a 15 segundos. Depois, use a espátula fria para retirar o tecido moído do argamassa em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Use uma pipeta de 1000 microlitros para adicionar 600 microlitros de solução de lise de núcleos à amostra. Depois, faça um vórtice na amostra por um a três segundos. Incube o tubo a 65 graus Celsius, em banho-maria por 15 minutos.

Após o término do período de incubação, use uma pipeta de 10 microlitros para adicionar 3 microlitros de solução de RNase ao lisado e remover o RNA. Depois, misture o conteúdo do tubo invertendo-o de duas a cinco vezes.

Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos em uma incubadora de armário. Após 15 minutos, adicione 200 microlitros de solução de precipitação proteica à amostra. Faça vórtice no tubo em alta velocidade por 20 segundos. Em seguida, centrifuge a amostra a 13000 g por três minutos.

Durante a centrifugação, adicione 600 microlitros de isopropanol mantido em temperatura ambiente a um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo da centrífuga para o tubo contendo isopropanol. Descarte a cápsula.

Inverta o tubo para que o DNA fique visível, como uma fita fio. Em seguida, centrifuge a amostra a 13000 g por um minuto em temperatura ambiente.

Decante o sobrenadante após a centrifugação. Depois, adicione 600 microlitros de etanol a 70% ao pellet. Inverta o tubo várias vezes para lavar o pellet.

Centrifuge o tubo a 13.000 g por um minuto. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Depois, inverta o tubo com a tampa aberta em um papel absorvente para secar ao ar livre por 15 minutos.

Depois de seco, adicione 100 microlitros de solução de reidratação de DNA ao pellet. Incube a suspensão de DNA a 65 graus Celsius em banho-maria por uma hora. Bata o tubo periodicamente durante a mistura.

Adicione 1 microlitro de água purificada em uma micro-cuvette. Leia a água como em branco no espectrofotômetro. Depois, adicione 1 microlitro da amostra na microcubeta. Coloque a microcuveta no espectrofotômetro e obtenha a concentração de DNA.