Name: Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática em mioblastos por citometria de fluxo. Este método permite analisar a resposta à insulina e comparar células saudáveis com resistentes à insulina.

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Este trabalho foi financiado por concessões do Clifford Sra. Elder Branco Graham Dotado Fundo de Investigação e do NIH (AR059838) para CB, do NIH (AR052791, AR044387-ARRA, e NS063298) para LTT, e pelo Baylor College of Medicine Citometria e Cell Sorting Core com financiamento do NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, e NCI P30CA125123). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.

1. A coloração de células <ol><li> Prepare as células. As células devem ser usados ​​ao mesmo tempo crescendo ativamente (6-80 confluência%). Soro fome as células durante a noite, as células da placa-los em 0,1 milhões por poço em 0,5 mL meio isento de soro em uma placa de 24 poços e colocar na incubadora (37 ° C CO, 5% 2) por 30 min - 2 horas para se recuperar de tripsinização. </li><li> Misture os anticorpos primário e secundário. Mix (5 mL de anticorpos anti-GLUT4 primária com uma secundária de frango mL anti-IgG de cabra conjugado com AlexaFluor 488) x número de poços. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Prepare um estoque 2X de trabalho da insulina, diluindo-o em médio prazo. </li><li> Verifique se as células aderiram ou não. </li><li> Delicadamente adicionar 6 mL mix de anticorpos e 0,5 mL de seu estoque de insulina 2X trabalhar aos poços contendo as células. Evitar qualquer turbulência do meio. Incubar (37 ° C, 5% CO 2) por 30 minutos, no escuro. </li><li> Fixar as células, adicionando 0,5 mL de PBS + PFA 1% a cada poço, sem agitar as células. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Se suas células aderiram aos poços, levantar delicadamente os com um levantador de células. Transferência de células (1 total mL) em tubos que se encaixam na sua citômetro de fluxo e centrifugar para agregar as células. </li><li> Lave o pellet duas vezes com 1 mL de PBS e ressuspender em 0,4 mL de PBS + 1% PFA. Neste ponto, as células podem ser embrulhados em papel alumínio e armazenados na geladeira (4-8 ° C) ou levado para o citômetro de fluxo para aquisição de dados imediatos. </li></ol> 2. Aquisição de Dados <ol><li> Definir uma porta ampla em torno das células vivem na dispersão lateral (SSC) versus dispersão frente do painel (FCS). Use um tubo negativo (células não tratadas com insulina ou células "manchado" com um controle de isotipo) para definir o parâmetro FL1. Verifique se o seu pico é completamente no painel, não cortados no lado inferior. </li><li> Aquisição de dados de pelo menos 10 mil células por tubo. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Desenhar uma porta em torno das células vivem no SSC FSC vs painel (Figura 1A). Plotar os histogramas de intensidade AlexaFluor 488 fluorescência versus número de células dentro do portão live-celular (Figura 1B). Você pode sobrepor histogramas diferentes de visualizar as diferenças, mas para a quantificação, determinar a intensidade média e mediana de fluorescência para cada população de células e usar esses números para o seu comparações (Figura 1C). </li><li> Normalizar os dados para o valor obtido na ausência de insulina, como mostrado nas Figuras 1C e 1D. </li></ol> 4. Resultados representante Em mioblastos isolado de um indivíduo saudável (sem resistência à insulina), a insulina induz a uma translocação dose-dependente de GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática (Figura 1, esquerda). Em contraste, a insulina não induz a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática dos mioblastos isolado de um paciente com resistência à insulina (Figura 1, à direita). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Exemplo de um experimento de coloração. Mioblastos foram isolados de um doador sem resistência à insulina (esquerda) e de um paciente com resistência à insulina (direita). A, SSC (Side Scatter) versus FCS parcela (para a frente de dispersão) com uma porta em torno da formação de células vivas. B, células gated em A, coradas com o anticorpo contra um epítopo externa do GLUT4, e deixou unstimulated (vermelho) ou estimuladas com insulina 1 nM (azul), 10 nm (laranja), ou 100 nM (verde). Para maior clareza a figura, só mostram dados sem e com 100 nM de insulina para as células com resistência à insulina. C, média intensidade de fluorescência (IMF) da histogramas mostrados na B foram normalizados para a IMF das células não estimuladas esquerdo (não insulina). D, Plots dos dados normalizados IFM da histogramas mostrados na B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos uma técnica rápida para quantificar a translocação de GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática de células por citometria de fluxo. GLUT4 é apenas transitoriamente expressa na membrana plasmática das células e é endocytosed. Desde a anticorpos ligados permanecer ligada ao GLUT4, mesmo durante a endocitose, o sinal de fluorescência fornece a quantidade total de GLUT4 que foi exposto na membrana plasmática durante o período de incubação escolhido na presença de insulina. Esta técnica também pode ser aplicado para estudar a translocação de outras proteínas a partir de um compartimento intracelular para a membrana plasmática, desde um anticorpo boa direcionado para um epítopo externa da proteína de interesse está disponível. Por exemplo, um ensaio semelhante agora é comumente utilizado para avaliar a taxa de degranulação dos linfócitos T citotóxicos e linfócitos natural killer, medindo a translocação de CD107a à sua membrana plasmática 4,5. A translocação de fosfatidilserina do lado interno da membrana plasmática para o lado externo durante a apoptose ou necrose celular também pode ser detectada por citometria de fluxo, usando fluoróforo marcado anexina V 6. Além de rapidez do ensaio, citometria de fluxo apresenta a vantagem de permitir o estudo de translocação de proteínas para a membrana plasmática nas populações de células mistas. De fato, pode-se combinar coloração para marcadores subconjunto de células e para a proteína de interesse, seguido de aquisição de dados em um citômetro de fluxo de multi-laser 7. As quantidades de anticorpos enunciados no ponto 1.2 do protocolo são um ponto de partida, e recomendamos que o seu titular anticorpos com suas células de interesse para determinar a concentração de anticorpos mínimo que lhe dá um sinal máximo. Uma boa variedade de partida para o anticorpo anti-humano primário GLUT4 temos usado aqui seria mL 10-10 por tubo (ou seja, anticorpos 0,2-2 mg por tubo), cada tubo contendo não mais de 1 milhão de células. Para outros anticorpos primários, consulte as instruções do fornecedor. Normalização dos dados é necessária como autofluorescência de células irão variar de doadores para o doador e de experimento para experimento.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos anti-humano GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Contra um epítopo externo de GLUT4</td></tr><tr><td>Imunoglobulina G (IgG) de galinha anti-cabra conjugada com AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Elevadores de células (cell lifters)</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Cortados para se adaptarem aos poços</td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml para FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Compatíveis com todas as máquinas BD</td></tr></tbody></table>

medição quantitativa do glut4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

A glicose é a principal fonte de energia para o corpo, exigindo uma regulação constante de sua concentração no sangue. Liberação de insulina pelo pâncreas induz a absorção de glicose por tecidos sensíveis à insulina, principalmente o cérebro, músculo esquelético e adipócitos. Pacientes que sofrem de diabetes tipo 2 e / ou obesidade freqüentemente desenvolvem resistência à insulina e são incapazes de controlar sua homeostase da glicose. Novos insights sobre os mecanismos de resistência à insulina pode fornecer novas estratégias de tratamento para diabetes tipo 2. A família dos transportadores de glicose GLUT consiste de treze membros distribuídos em diferentes tecidos em todo o corpo 1. Transportador de glicose tipo 4 (GLUT4) é o transportador principais que medeia a captação de glicose pelos tecidos sensíveis à insulina, tais como o músculo esquelético. Após a ligação da insulina ao seu receptor, vesículas contendo GLUT4 translocate do citoplasma para a membrana plasmática, induzindo a captação de glicose. Reduziu a translocação do GLUT4 é uma das causas da resistência à insulina em diabetes tipo 2 2,3. A translocação de GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática pode ser visualizado por imunocitoquímica, utilizando fluoróforos GLUT4 anticorpos específicos. Aqui, descrevemos uma técnica para quantificar a quantidade total de GLUT4 translocação para a membrana plasmática das células durante um período escolhido, utilizando citometria de fluxo. Este protocolo é rápida (menos de 4 horas, incluindo a incubação com insulina) e permite a análise de tão poucos como 3.000 células ou mais de 1 milhão de células por condição em um único experimento. Ele se baseia em anticorpos anti-GLUT4 direcionado para um epítopo externa do transportador que se ligam a ele, logo que ela está exposta para o meio extracelular após a translocação para a membrana plasmática.

Este protocolo descreve uma técnica rápida para quantificar a translocação do GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática de células por citometria de fluxo.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

A glicose é a principal fonte de energia para o organismo, exigindo a regulação constante de sua concentração sanguínea. A liberação de insulina pelo pâncreas induz...

O objetivo geral deste procedimento é detectar a translocação da GLUT4 para a membrana plasmática de células de mamíferos em resposta à exposição à insulina. Miotubos privados de soro, que possuem apenas a proteína GLUT4 intravesicular, são inicialmente semeados em uma placa de cultura de 24 poços com um anticorpo contra um epítopo externo da GLUT4. Um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo é então adicionado às células, seguido pela insulina.O engajamento dos receptores de insulina na superfície das células resulta na translocação da glute quatro para a superfície da membrana plasmática. A glute quatro é então reconhecida por anticorpos no meio. Nesse ponto, as células podem ser fixadas e a intensidade da marcação fluorescente pode ser medida por citometria de fluxo.Este método pode ser utilizado para estudar a translocação de GGL quatro e o metabolismo da glicose, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como a desgranulação de células NK mediante a exposição de CD107a na membrana. Para este procedimento, é importante utilizar células que estejam em crescimento ativo ou com confluência entre 60 e 80% e que tenham sido privadas de soro durante a noite. Após a coleta das células por tripsinização, lave e ressuspenda-as em meio de crescimento comum a 200.000 células por mililitro, plaque as células em uma placa de 24 poços com 0,1 milhão por 500 microlitros por poço. Incube então as células por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que se recuperem da tripsina.Enquanto isso, misture o anticorpo primário anti-glute quatro e o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488, anticora de galinha IgG, numa proporção de cinco para um, calcule o volume final necessário, levando em consideração que 10 microlitros da mistura de anticorpos serão utilizados para cada poço. Incube a mistura de anticorpos por 10 minutos à temperatura ambiente, no escuro, enquanto a mistura de anticorpos está incubando. Prepare um estoque de trabalho duas vezes concentrado de insulina diluindo-a até a concentração desejada no meio de crescimento.Após a incubação das células por uma hora, remova-as do incubador. Adicione cuidadosamente 10 microlitros de solução de anticorpo a cada poço contendo células. Certifique-se de deixar pelo menos um poço sem coloração.Esta amostra negativa será usada posteriormente para configurar o citômetro de fluxo. Em seguida, adicione 500 microlitros do estoque de insulina duas vezes a cada poço para induzir a translocação do glute quatro para a superfície celular e incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Após remover as células do incubador, fixe-as adicionando um mililitro de PBS 1%PFA a cada poço e incube a placa por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro; usando um levantador de células, desprenda suavemente as células fixadas do fundo dos poços e transfira-as de cada poço para um tubo fax individual.Centrifugue os tubos para fazer um pellet das células, depois vortexe e re-suspenda-as em um mililitro de PBS para lavar e centrifugar as células novamente; repita a lavagem. Etapa duas vezes. Descartando o sobrenadante entre as lavagens.Por fim, ressuspenda as células lavadas em 400 microlitros de PBS com 1% de PFA. As células podem agora ser analisadas quanto à expressão superficial da glute quatro no citômetro de fluxo. Após chegar ao citômetro de fluxo com suas amostras, comece a adquirir dados a partir do controle não corado.Defina um gate amplo para células vivas utilizando os parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral. Em seguida, ajuste a configuração de voltagem para o canal FL1 de modo que o pico negativo seja visível dentro das margens do histograma. Uma vez que esses parâmetros tenham sido definidos, execute cada amostra experimental, registrando pelo menos 10.000 eventos vivos por tubo.Este histograma mostra a superexpressão da marcação da força de glutamina na superfície de mioblastos expostos à insulina nas concentrações de 0, 1, 10 ou 100 nanomolares. Em contraste, mioblastos de indivíduos resistentes à insulina não conseguem superexpressar o glu quatro em resposta à insulina 100 nanomolar. Se as intensidades médias de fluorescência das células estimuladas forem normalizadas em relação às células não estimuladas, é possível comparar diretamente as IMFs de mioblastos saudáveis e resistentes à insulina.Utilizando este procedimento, as células podem ser coradas para marcadores adicionais de superfície ou intracelulares para identificar diferentes subpopulações celulares em populações mistas.

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Research

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Biology

Biologia

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Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

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