Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é detectar a translocação da GLUT4 para a membrana plasmática de células de mamíferos em resposta à exposição à insulina. Miotubos privados de soro, que possuem apenas a proteína GLUT4 intravesicular, são inicialmente semeados em uma placa de cultura de 24 poços com um anticorpo contra um epítopo externo da GLUT4. Um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo é então adicionado às células, seguido pela insulina.

O engajamento dos receptores de insulina na superfície das células resulta na translocação da glute quatro para a superfície da membrana plasmática. A glute quatro é então reconhecida por anticorpos no meio. Nesse ponto, as células podem ser fixadas e a intensidade da marcação fluorescente pode ser medida por citometria de fluxo.

Este método pode ser utilizado para estudar a translocação de GGL quatro e o metabolismo da glicose, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como a desgranulação de células NK mediante a exposição de CD107a na membrana. Para este procedimento, é importante utilizar células que estejam em crescimento ativo ou com confluência entre 60 e 80% e que tenham sido privadas de soro durante a noite. Após a coleta das células por tripsinização, lave e ressuspenda-as em meio de crescimento comum a 200.000 células por mililitro, plaque as células em uma placa de 24 poços com 0,1 milhão por 500 microlitros por poço. Incube então as células por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que se recuperem da tripsina.

Enquanto isso, misture o anticorpo primário anti-glute quatro e o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488, anticora de galinha IgG, numa proporção de cinco para um, calcule o volume final necessário, levando em consideração que 10 microlitros da mistura de anticorpos serão utilizados para cada poço. Incube a mistura de anticorpos por 10 minutos à temperatura ambiente, no escuro, enquanto a mistura de anticorpos está incubando. Prepare um estoque de trabalho duas vezes concentrado de insulina diluindo-a até a concentração desejada no meio de crescimento.

Após a incubação das células por uma hora, remova-as do incubador. Adicione cuidadosamente 10 microlitros de solução de anticorpo a cada poço contendo células. Certifique-se de deixar pelo menos um poço sem coloração.

Esta amostra negativa será usada posteriormente para configurar o citômetro de fluxo. Em seguida, adicione 500 microlitros do estoque de insulina duas vezes a cada poço para induzir a translocação do glute quatro para a superfície celular e incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Após remover as células do incubador, fixe-as adicionando um mililitro de PBS 1%PFA a cada poço e incube a placa por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro; usando um levantador de células, desprenda suavemente as células fixadas do fundo dos poços e transfira-as de cada poço para um tubo fax individual.

Centrifugue os tubos para fazer um pellet das células, depois vortexe e re-suspenda-as em um mililitro de PBS para lavar e centrifugar as células novamente; repita a lavagem. Etapa duas vezes. Descartando o sobrenadante entre as lavagens.

Por fim, ressuspenda as células lavadas em 400 microlitros de PBS com 1% de PFA. As células podem agora ser analisadas quanto à expressão superficial da glute quatro no citômetro de fluxo. Após chegar ao citômetro de fluxo com suas amostras, comece a adquirir dados a partir do controle não corado.

Defina um gate amplo para células vivas utilizando os parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral. Em seguida, ajuste a configuração de voltagem para o canal FL1 de modo que o pico negativo seja visível dentro das margens do histograma. Uma vez que esses parâmetros tenham sido definidos, execute cada amostra experimental, registrando pelo menos 10.000 eventos vivos por tubo.

Este histograma mostra a superexpressão da marcação da força de glutamina na superfície de mioblastos expostos à insulina nas concentrações de 0, 1, 10 ou 100 nanomolares. Em contraste, mioblastos de indivíduos resistentes à insulina não conseguem superexpressar o glu quatro em resposta à insulina 100 nanomolar. Se as intensidades médias de fluorescência das células estimuladas forem normalizadas em relação às células não estimuladas, é possível comparar diretamente as IMFs de mioblastos saudáveis e resistentes à insulina.

Utilizando este procedimento, as células podem ser coradas para marcadores adicionais de superfície ou intracelulares para identificar diferentes subpopulações celulares em populações mistas.