Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:35 min. • November 28th, 2025
Comece com uma placa de cultura contendo bactérias embutidas sob uma almofada de gel de agarose para imobilizar as bactérias e apoiar o crescimento de uma monocamada.
As bactérias expressam constitutivamente a proteína fluorescente verde, permitindo o monitoramento em tempo real da expressão gênica.
Despeje gel adicional de agarose ao redor da amostra para selar a amostra e deixe-a solidificar em temperatura ambiente.
Sele a placa com fita, perfure-a para permitir a troca de gases e inverta-a para evitar condensação.
Incube a placa em baixa temperatura para estabilizar o gel e evitar a divisão bacteriana.
Em seguida, aplique óleo de imersão no objetivo e coloque a placa sobre um palco de microscópio confocal.
Inicie a imagem em time-lapse.
À medida que a GFP amadurece gradualmente, ela começa a fluorescer. Durante a divisão celular, essas proteínas fluorescentes são distribuídas entre as células-filhas, causando uma queda na intensidade da fluorescência.
Isso cria um padrão de fluorescência em forma de serra, e diferenças nesse padrão entre células geneticamente idênticas no mesmo ambiente mostram ruído biológico na expressão gênica.
Para capturar as amostras, retire o frasco da água e deixe a solução de gel esfriar até a temperatura corporal. Despeje três milímetros do gel sobre o perímetro da placa da amostra. Quando a agarose estiver solidificada, sele a placa com fita e use uma agulha calibre 25 para furar vários furos na fita.
Depois, coloque a placa de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos para permitir que a agarose solidifique completamente, evitando a mitose celular. Em até 24 horas, utilize um microscópio confocal de fluorescência para localizar a amostra com a menor ampliação e acionar o sistema automático de foco do microscópio. Aplique óleo no objetivo apropriado e use o controlador da plataforma para mover a placa e espalhar cuidadosamente o óleo.
Depois, ative novamente o foco automático e siga a sugestão padrão para Z seções transversais em passo para imagear a amostra.