Hibridização in situ por fluorescência de bactérias intestinais em seções intestinais de camundongos

Comece adicionando uma solução contendo sondas bacterianas de hibridização in situ (FISH) específicas para 16S rRNA a uma lâmina contendo as seções intestinais do camundongo colonizadas por bactérias.

Coloque uma cobertura para espalhar as sondas contendo líquido e evitar a evaporação.

Incube a lâmina em uma câmara umidificada em temperatura elevada.

Isso desdobra a estrutura secundária do RNA, facilitando a hibridização da sonda com sequências complementares no rRNA bacteriano 16S.

Remova a cobertura e incube a lâmina em um buffer de lavagem pré-aquecido para remover as sondas não ligadas.

Enxágue com um tampão fosfatado para manter o pH fisiológico.

Aplique um contra-contraste contendo um corante específico para muco e um corante nuclear, e incube.

Esses corantes se ligam seletivamente ao muco intestinal e ao DNA das células bacterianas e hospedeiras. Lave o ferrolho com um buffer e monte os coverslips no ferrolho usando meio de montagem.

Sob um microscópio confocal, observe bactérias distintas marcadas como FISH, células intestinais e a camada de muco dentro das seções.

Crie círculos muito próximos ao redor de cada seção de tecido usando um bloqueador líquido ou caneta PAP para limitar a área de expansão que precisa ser coberta pela solução de hibridização, evitando o contato da tinta com a secção.

Prepare a solução de hibridização e adicione 0,5 micrograma de sonda para cada 50 microlitros da solução utilizada. Pipete a solução nas seções da lâmina. Cubra a seção com lâminas plásticas flexíveis, garantindo que o volume de líquido utilizado cubra toda a seção.

Crie uma câmara úmida com uma caixa de ponta de pipeta com lenços umedecidos ou papel toalha que tenham sido embebidos com solução de hibridização excessiva ou PBS para fornecer umidade. Incube a lâmina na câmara úmida a 45 a 50 graus Celsius por pelo menos três horas, dependendo da sonda configurada para reduzir a evaporação. Remova as lâminas plásticas e incube as lâminas em um buffer de lavagem FISH em um pote Coplin, ambos pré-aquecidos a 50 graus Celsius.

Coloque o pote Coplin de volta no forno a 50 graus Celsius por 10 a 20 minutos. Remova o buffer de lavagem FISH e substitua por PBS no pote Coplin. Imediatamente após reabastecer o pote de Coplin com PBS, decante o PBS.

Remova as lâminas do pote e pipete a contramancha em cima de toda a seção, tomando cuidado para não tocar no papel com a ponta da pipeta. Incube a 4 graus Celsius por 45 minutos. Lave as manchas três vezes rapidamente com PBS novo.

Passe a parte de trás dos slides contra um lenço ou papel toalha e deixe a maior parte do PBS evaporar das seções auxiliado por uma linha de vácuo conectada à ponta de uma pipeta. Monte as seções usando um meio de montagem. Fixe as capas na lâmina pintando as bordas com esmalte transparente, tomando cuidado para não ficar longe da borda da lâmina. Deixe firmar em temperatura ambiente.