Hibridização in situ por fluorescência de bactérias intestinais em seções intestinais de camundongos

Comece adicionando uma solução contendo sondas bacterianas de hibridização in situ (FISH) específicas para 16S rRNA a uma lâmina contendo as seções intestinais do camundongo colonizadas por bactérias.

Coloque uma cobertura para espalhar as sondas contendo líquido e evitar a evaporação.

Incube a lâmina em uma câmara umidificada em temperatura elevada.

Isso desdobra a estrutura secundária do RNA, facilitando a hibridização da sonda com sequências complementares no rRNA bacteriano 16S.

Remova a cobertura e incube a lâmina em um buffer de lavagem pré-aquecido para remover as sondas não ligadas.

Enxágue com um tampão fosfatado para manter o pH fisiológico.

Aplique um contra-contraste contendo um corante específico para muco e um corante nuclear, e incube.

Esses corantes se ligam seletivamente ao muco intestinal e ao DNA das células bacterianas e hospedeiras. Lave o ferrolho com um buffer e monte os coverslips no ferrolho usando meio de montagem.

Sob um microscópio confocal, observe bactérias distintas marcadas como FISH, células intestinais e a camada de muco dentro das seções.

Crie círculos muito próximos ao redor de cada seção de tecido usando um bloqueador líquido ou caneta PAP para limitar a