JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:04 min • January 30th, 2026
Comece com uma cultura de Legionella pneumophila, uma bactéria patogênica Gram-negativa que libera vesículas da membrana externa.
Esses OMVs carregam lipopolissacarídeos e proteínas membranares que contribuem para a virulência bacteriana.
Centrifuge a cultura para pelletar bactérias intactas.
Colete os OMVs que contenham o sobrenadante e centrifuge novamente para pelletar as bactérias residuais.
Filtre o sobrenadante através de uma membrana para remover as bactérias restantes enquanto retém os OMVs.
Realize uma segunda filtragem usando uma membrana nova para remover detritos bacterianos.
Colete o filtrado livre de bactérias e ultracentrífuge para pelletar os OMVs.
Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um tampão e faça a ultracentrífuga novamente para remover proteínas e lipopolissacarídeos frouxamente associados.
Remova o sobrenadante e resuspenda os OMVs purificados em buffer.
Estrie uma alíquota dos OMVs em ágar sanguíneo e placas de ágar BCYE e incube.
A ausência de formação de colônias confirma a ausência de contaminação bacteriana.
Armazene os OMVs em baixa temperatura para estudos de interação hospedeiro-patógeno.
Adicione a cultura líquida restante a 90 mililitros de meio YEB fresco e incube a cultura em um shaker rotativo até atingir um OD600 de 3,0 a 3,5. Centrifuge a cultura líquida a 4.000 g por 20 minutos para pelletar as bactérias. Depois, transfira o sobrenadante para tubos centrífugos novos.
Descarte os pellets bacterianos e centrifuge as amostras novamente antes de repetir a etapa de centrifugação mais uma vez. Em seguida, esterilize o sobrenadante restante duas vezes.
Depois, transfira o sobrenadante livre de bactérias para tubos de ultracentrífuga e gire as amostras a 100.000 g em 4 graus Celsius por 3 horas. Decante o sobrenadante e descarte-o. Depois, use PBS estéril para ressuspender os pellets OMV e acumulá-los.
Repita a etapa da ultracentrifugação para remover proteínas contaminantes e LPS livre. Agora, descarte o sobrenadante e seque o tubo da ultracentrífuga com um cotonete estéril. Resuspenda o pellet OMV com 500 microlitros de PBS estéril.
Depois, estire 20 microlitros em cada placa de ágar sanguíneo e placas de ágar BCYE para excluir a contaminação bacteriana da vesícula preparada. Incube a placa de ágar sanguínea durante a noite e a placa de ágar BCYE por 3 dias.