Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:02 min. • February 2nd, 2026
Veja RNA total extraído de um cérebro de camundongo infectado por bactérias patogênicas. O extrato contém transcritos de genes responsivos à infecção.
Adicione uma enzima que degrade o DNA e incube para degradar o DNA genômico residual.
Adicione uma mistura mestre contendo a enzima transcriptase reversa (RT), nucleotídeos e primers inespecíficos.
Incubar para sintetizar DNA complementar (cDNA).
Introduza uma temperatura alta para inativar a enzima RT.
Pegue uma mistura mestre contendo DNA polimerase, nucleotídeos, um corante de dupla fita que liga o DNA e primers específicos para um gene alvo.
Adicione o cDNA e aplique calor para desnaturalizar o DNA.
O primer se liga ao cDNA alvo, permitindo a síntese de novas fitas de DNA.
O ciclo é repetido para amplificar o gene alvo.
O corante se liga ao DNA amplificado e emite fluorescência, que é registrada ao final de cada ciclo.
O aumento da fluorescência confirma a expressão do gene responsivo à infecção no cérebro do camundongo infectado.
Infecte todos os camundongos usando células planctônicas ou células do estado de biofilme e realize a eutanásia conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, extraia o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.
Para cada camundongo, use tecido cerebral inteiro para extrair RNA. Divida o tecido cerebral inteiro em cinco tubos. Pegue até 100 miligramas de tecido cerebral e adicione 1 mililitro de solução de lise a cada tubo contendo a matriz de lise fornecida pelo kit.
Extraia o RNA seguindo os passos listados no protocolo de texto. Em seguida, realize a síntese de cDNA, incluindo a eliminação do DNA genômico, usando um termociclador com um kit de reagentes de transcrição reversa. Adicione 1 micrograma de RNA a um tubo contendo 2 microlitros de 5x tampão de eliminação de DNA genômico e 1 micrólitro de enzima de eliminação genômica.
Adicione água sem RNase até que o volume atinja 10 microlitros. Incube por 2 minutos a 42 graus Celsius. Adicione 10 microlitros de mistura master à solução de reação e depois misture suavemente.
Proceda imediatamente à reação de transcrição reversa colocando o tubo a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois, transfira a reação para 85 graus Celsius por 5 segundos. Realize a análise quantitativa de PCR em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real com um kit de PCR ciber-quantitativo em tempo real. Seguindo as instruções do kit, combine a enzima, os primers, o corante de referência ROX 50x dois e o molde de cDNA. Depois, adicione água sem RNase até atingir um volume total de 20 microlitros.
Execute cada amostra em triplicado usando os parâmetros térmicos listados no protocolo de texto e calcule a variação relativa de fold com base no método CT de dois delta delta menos.