Infecção Oral de Drosophila melanogaster com Bactérias Patogênicas

Pegue um frasco com tampa que contenha ágar nutritivo sobre papel filtrante.

Aplique uma suspensão de bactérias patogênicas sobre o papel filtrante.

Introduza uma mosca de Drosophila melanogaster faminta no frasco e coloque a tampa. Incube para permitir a alimentação e garantir a ingestão bacteriana.

As bactérias ingeridas entram no intestino e penetram a membrana protetora que revestem o lúmen.

As bactérias aderem ao epitélio subjacente, liberam toxinas que promovem danos e invasão epitelial, e colonizam os tecidos internos.

Mergulhe a mosca em álcool para remover bactérias associadas à superfície, depois enxágue para remover o álcool.

Adicione um tampão e homogeneize a mosca para liberar o conteúdo interno das bactérias.

Realize diluições seriadas do homogeneado em uma microplaca. Em seguida, placar as diluições sobre ágar nutritivo e incubar para permitir a formação da colônia.

Conte as colônias para determinar o número de células bacterianas viáveis resultantes da infecção oral na mosca.

Duas a quatro horas antes da infecção oral, transfira as moscas para frascos de ágar padrão que não contenham comida. Enquanto isso, para cada mosca, prepare um frasco para infecção.

Primeiro, carregue a tampa de um tubo de amostra de 7 mililitros com 500 microlitros de ágar de açúcar padrão e deixe solidificar. Em seguida, coloque um disco de papel de filtro no ágar. Depois, pipete 100 microlitros de cultura bacteriana diretamente sobre o disco filtrante. Para os controles, use água com sacarose a 5%.

Após o período de fome, transfira moscas individuais para os tubos preparados. Após incubar as moscas por 18 a 24 horas, esterilize-as na superfície. Coloque os indivíduos em um tubo contendo 100 microlitros de 70% de etanol.

Após 20 a 30 segundos, retire o etanol e substitua por 100 microlitros de água tripla destilada. Após mais 20 a 30 segundos, retire a água. Depois, adicione 100 microlitros de PBS e homogeneize a mosca.

Transfira o homogeneado para a fileira superior de uma placa de 96 poços e adicione 90 microlitros de 1x PBS a cada poço abaixo. Depois, usando alíquotas de 10 microlitros, dilua serialmente essa amostra para distinguir uma faixa de valores de CFU. Em seguida, coloque as diluições seriadas em uma placa de ágar nutritivo LB com gotículas de 5 microlitros.

Posicione as gotículas de forma que fiquem discretamente localizadas na placa. Depois, incube o prato durante a noite. No dia seguinte, calcule o número de CFUs a partir da diluição que produz de 10 a 60 colônias claramente visíveis.